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目的:通过建立单个T细胞的分离和基因扩增技术,来获取识别特定抗原表位肽的单个T细胞的TCR基因,为特异性TCR的获取提供了一种新方法,为以后获取肿瘤特异性TCR基因并利用特异性TCR基因修饰T细胞进行过继性免疫治疗打下基础。方法:一、单个淋巴细胞的手工显微分离及单细胞水平的RT-PCR扩增利用自制的毛细玻璃管、橡胶管和滤嘴组装成一套完整的单细胞分离工具,通过该分离工具分离出单个T淋巴细胞,然后使用不同的试剂盒进行反转录和GAPDH基因扩增,通过对比确定出扩增效率高的反转录试剂盒,并通过扩增BCL2、STAT1和CD8a基因进一步验证其扩增效率,优化其相应扩增条件,为扩增单个T淋巴细胞的TCR基因奠定实验基础。二、单个T细胞TCRA基因扩增方法的建立通过自制的手工分离单细胞工具分离出单个经特定富集的CD8~+T细胞后,分别采用5’RACE法和多重PCR法扩增单个T细胞的TCRA基因。通过采用不同的扩增条件、不同的特异性引物和不同的PCR扩增酶进行5’RACE法扩增TCRA基因条件的摸索;通过常规PCR和分步PCR法进行多重PCR法扩增TCRA基因的条件摸索。三、TCR(α和β链)重组表达载体的构建将第二部分单细胞扩增获得的TCR基因核心序列(CDR3)分别与对应的上游V区和下游C区片段通过融合PCR的方法拼接出全长序列。然后根据插入的目的基因和载体序列设计合理的同源重组引物和含酶切位点引物进行TCRα和TCRβ基因的扩增,后与pIRES2-Oligo载体连接,构建出TCR的重组表达载体。结果:一、成功组装单细胞分离工具并建立了手工显微分离单个T淋巴细胞的方法;通过对单个T细胞丰度较高的GAPDH基因扩增,摸索出了稳定的单细胞反转录和扩增方法,并通过扩增单个T细胞的BCL2、STAT1和CD8a基因得到了进一步的验证,为扩增单个T细胞的TCR基因奠定了实验基础。二、5’RACE法扩增单个T细胞的TCRA基因效果不理想。后对多重PCR扩增单个T细胞TCRA基因的方法进行优化,成功扩增出2个CD8~+T细胞各自的TCRA基因:1号细胞的TCRVα16和TCRVα2/3、4号单细胞的TCRVα26和TCRVα1/5。三、通过融合PCR法成功扩增出TCRβ5、TCRα1/5和TCRα26的全长序列。利用同源重组和酶切的方法成功构建出pIRES2-TCRβ5-TCRα1/5和pIRES2-TCRβ5-TCRα26重组表达载体。结论:本实验成功建立了单个T淋巴细胞的手工显微分离和基因扩增方法,在此基础上通过对单细胞TCR基因的方法摸索,成功建立了分步多重PCR扩增单个T细胞TCR基因的方法。该技术的建立为快速获取TCR-T细胞免疫治疗所需的特异性TCR基因提供了新的方法与思路,为促进TCR-T过继性细胞免疫疗法的应用研究奠定了基础。