植物体中的硫氧还蛋白可以通过调节细胞内氧化还原环境来调控很多酶的活性,最终在植物的氧化还原调节、生长、发育和抗病等过程中发挥了非常重要的作用。本论文就烟草中一个被氧胁迫和病毒所特异性诱导的硫氧还蛋白——NtTRXh展开研究,通过一系列的生物化学、分子生物学和遗传学手段,对其结构和消除植物体内多余活性氧、增强植物抗病性的功能进行了较详细的阐释。另外一种可以提高植物抗病性的蛋白质——激发子HrpNEa,它是植物病原细菌(梨火疫病菌Erwinia amylovora)产生的一种Ⅲ型效应因子。将它外源喷施于植物地上部分时,可以诱导系统抗病性。然而,它能否作用于植物根部呢?为此,本论文选择大白菜与软腐病菌这一互作系统来研究HrpNEa是否能在植物根部诱导抗病性。1.NtTRXh基因克隆、表达及功能的分析实验证明,普通烟草中目前发现的三个h型TRX(Nicotiana tabacum thioredoxin h-like protein)基因(NtTRXhl, NtTRXh2, NtTRXh)中的NtTRXh(AF435818)特异性的受到氧胁迫剂百草枯(Paraquat)和病毒TMV的诱导表达,并克隆了该基因。序列的同源性分析表明,NtTRXh具有完整的TRX蛋白质的活性位点WCGPC,属于thioredoxin h中的第三亚家族。在大肠杆菌内表达NtTRXh,并利用金属螯合层析(Ni柱)纯化。125μg／ml纯化后的NtTRXh溶液不能引起烟草叶片的过敏反应,这说明NtTRXh本身对植物的细胞没有损害。根据TRX蛋白质催化胰岛素二硫键的性质,测定了NtTRXh的催化活性,判定它具备催化二硫键(TRX蛋白质的特性)的性质。然后,我们利用PCR点突变的方法将其功能域上的两个位点突变,并表达、纯化得到的三个突变体(C13T,C68T,C13TC68T)。同时,再次利用TRX蛋白质催化胰岛素二硫键的性质,平行测定了NtTRXh及三个点突变的蛋白质活性。结果表明,除活性位点WCGPC中的两个半胱氨酸(C)残基外,N端的一个半胱氨酸残基也参与了二硫键的催化反应。总之,我们克隆了烟草上可能参与清除活性氧和抗病功能的NtTRXh,将其进行表达纯化,并对它的活性和功能域进行了分析。2.NtTRXh增强烟草的抗病性而抑制烟草生长植物中存在许多TRXhs,这些蛋白在植物中的氧化还原调节、生长、发育和抗病等方面发挥着重要的作用。但是,大部分TRXh的功能还不清楚。前面的结果表明,NtTRXh可以被百草枯(诱导氧爆发)和病毒TMV诱导表达。为了鉴定NtTRXh在烟草中的功能,将其连接到可以被Harpin诱导的启动子PPP1前面,并构建到过量表达载体pBI121上,转化农杆菌EHA105。接着利用叶盘法进行烟草转基因,让该基因在烟草中过量表达。同时,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)将NtTRXh沉默。结果发现,用百草枯处理后,过量表达的植株(TRXOT1)中的活性氧比转空载体植株(ETT)少了很多。与此同时,当接种TMV时,在TRXOT1中,病斑明显减小了,抗病相关基因的表达比ETT增强了。此外,我们还发现,烟草的生长明显受到了抑制,烟草中与生长相关的基因表达减弱了。因此,NtTRXh不仅可以消除活性氧,增强抗病性,而且还抑制了植物的生长。同样,我们在WT和沉默植株(SiTRX)上也做了以上实验,结果表明,虽然WT和SiTRX之间存在的差别不如TRXOT1与ETT之间的差别大,但是同样证明了NtTRXh的功能。综上所述,我们通过过量表达与病毒诱导的基因沉默的方法,研究了NtTRXh在植物体内的功能,发现它可以消除活性氧,增强抗病性,而且抑制了植物的生长。3.NtTRXh在烟草中的亚细胞定位蛋白质是生物功能的直接体现者,有序分布的蛋白质是保证生命个体正常生长、发育的前提。植物基因的编码蛋白都是依据自身氨基酸序列所包含的定位信息,由精确的制导机制定位到细胞的特定部位的.蛋白质因目的地不同,而功能也不尽相同。因此,蛋白质的亚细胞定位研究对于系统地了解蛋白质在植物细胞中的作用是一个重要的环节.因为我们发现NtTRXh可以被百草枯诱导表达,而且又因为百草枯除草的机理是：它能被植物绿色组织吸收,在植物体内产生过氧化物,对植物绿色组织有很强的破坏作用,使光合作用和叶绿素合成很快中止,使绿色植物枯死,所以我们推测NtTRXh有可能定位于叶绿体,虽然还没有TRXhs定位于叶绿体的报道。而后,我们利用生物信息学方法分析、预测NtTRXh的亚细胞定位,发现它没有明显定位某个细胞器的信号肽。根据氨基酸组成算法预测,认为它可能定位于叶绿体、细胞质或者线粒体.为了确证它的亚细胞定位情况,我们利用免疫学的方法分析鉴定NtTRXh在烟草叶片上的亚细胞定位。我们将NtTRXh表达、纯化,通过免疫兔子制备了NtTRXh的多克隆抗体。再通过Western blot和免疫胶体金对NtTRXh的定位进行分析。结果发现叶绿体、细胞质或者线粒体中都有NtTRXh,而叶绿体中较多。这与我们原先的推测基本是一致的。而且,因为它的广泛分布,这从一定程度上解释了它可能参与了细胞的多种生理生化过程,在植物中发挥着多种重要的功能。4.HrpNEa诱导大白菜对软腐茵从根部侵染的抗性蛋白质激发子HrpNEa是植物病原细菌(梨火疫病菌Erwinia amylovora)产生的一种Ⅲ型效应因子。外源喷施于植物地上部分时,可以诱导植物的系统抗病性。然而,HrpNEa是否可以作用于植物根部几乎没有研究。本研究基于对HrpNEa的研究空缺和软腐病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora, Ecc)可以从根部侵染大白菜的特点设计实验,解析诱导大白菜抵抗软腐病菌从根部侵染的机制。首先利用荧光显微镜和电镜观察软腐病菌在根部的吸附,发现HrpNEa处理大白菜根部以后,不仅可以改变软腐病菌在根表的极性吸附形式,还可以降低软腐病菌在根表极性吸附的数量和吸附的总量。同时,利用报告菌检测软腐病菌群体感应分子的产生情况。群体感应是软腐病菌在侵染寄主过程中重要的影响因素。结果发现,HrpNEa处理大白菜根部以后,大大抑制了软腐病菌产生群体感应分子的能力。最后,检测了一些抗病相关基因等的表达情况。总之,HrpNEa处理大白菜根部可以影响软腐病菌在大白菜根表的侵染行为,从而提高了对软腐病菌的抗性,这揭示了植物中一种新的诱导抗病机制。5.总结本研究主要的发现与创新：第一,鉴定了烟草上参与清除活性氧和抗病功能的NtTRXh,并对它的活性和功能域进行了分析；第二,研究了NtTRXh在植物体内的功能,发现它可以消除活性氧,增强抗病性,而且抑制了植物的生长；第三,通过免疫学方法证明了NtTRXh主要定位于叶绿体；第四,试验证明,HrpNEa可以从植物根部发挥诱导效应,HrpNEa处理大白菜根部可以影响软腐病菌在大白菜根表的侵染行为,从而提高了对软腐病菌的抗性,揭示了植物中一种新的诱导抗病机制。本研究有两个主要缺点：第一,在植物体内,NtTRXh主要是通过调节一些蛋白的活性从而发挥其调控作用的,然而本研究没能找到NtTRXh作用的目的蛋白。第二,本研究虽然明确了HrpNEa在根部诱导植物抗病性的作用,但是没有进一步解析其分子机制。