本研究拟利用炭疽毒素保护性抗原（PA）的中和性单克隆抗体,结合毒素的结构和功能研究,确定PA的主要中和性表位,分析中和性表位与毒素作用分子机理的关系,观察这些表位在疫苗免疫过程中的意义。研究中用rPA免疫BALB/c小鼠,进行杂交瘤细胞融合和筛选,获得了9株具有中和活性的单克隆抗体。利用PA不同结构域重组蛋白进行western blot以及竞争抑制ELISA实验,发现这9株中和性单抗分别识别PA3个结构域的5个不同中和表位区,其中3株中和活性强于抗PA多抗的单抗均识别PA结构域2。结果表明PA具有多个中和表位,分别位于其不同结构域,其中结构域2、4包含主要中和表位。虽然无法与国外获得的单抗的中和活性进行直接比较,但与抗PA多抗的比较结果表明本研究获得的针对结构域2的单抗5E12、2A8、5E1具有较强的中和活性,不仅强于抗PA多抗,也强于其他中和性单抗,并且能够保护Fisher344大鼠免受毒素的攻击,这再次提示结构域2包含PA的重要中和性表位。首先对结合于PA结构域2同一个表位区并且中和活性比较高的三株单抗5E1、2A8和5E12使用NEB公司的线性12肽库和环7肽库进行了筛选,结果得到了一致性的序列“SFFD”,这与PA中312-315位氨基酸完全一致。这段序列位于PA结构域2的2β₂-2β₃ loop之中,并且是胰凝乳蛋白酶的识别位点。针对这一特性设计了蛋白酶切实验,蛋白酶切保护实验,并且构建了“SFFD”缺失的突变体。进一步证实了“SFFD”是这3株单抗识别的关键氨基酸位点。在动物免疫试验中,以筛选到的特异性的噬菌体克隆作为抗原,结果发现,在小鼠体内能产生针对PA的抗体,进一步证明该表位的特异性。但获得的抗体未显示明显的毒素中和活性,分析可能于表位序列较短,免疫原性差有关。以上的研究结果显示PA结构域2的2β₂-2β₃ loop中存在一个主要的中和性表位。在毒素作用的过程中,PA domain2的主要功能是形成跨膜孔道,为LF和EF进入胞质提供途径。在由prepore到pore的转变过程中,PA domain2的2β₂-2β₃ loop起着重要的作用,它从单体中的无序结构变成一个跨膜的β折叠结构。在PA七聚体形成过程中,2β₂-2β₃ loop伸到单体结构外,与邻近单体的domain2和4相互作用,这种作用可能对七聚体的稳定性有着一定的作用。利用软件Accelrys Discovery Stdio分析,单抗5E1识别的表位“SFFD”正好位于2β₂-2β₃ loop的中间位置,通过分析与表位序列相距7A的邻近PA单体的氨基酸位点发现,邻近PA单体的410、414、496、498、633、637、668、670、672、673位氨基酸与该表位可能存在着相互作用,这包含了与2β₂-2β₃ loop邻近的氨基酸,这一结果也证明2β₂-2β₃ loop在毒素作用过程中起的作用,可能全部或大部分由312-315位氨基酸来完成。同时单抗5E1能够抑制SDS-resistant七聚体的形成也证明这一中和性表位,在PA由prepore到pore的转变过程中起着重要的作用。很多研究表明rPA为基础的新型疫苗能够激起保护性免疫。本研究利用rPA疫苗作为免疫原,免疫动物。观察在疫苗免疫状态下,该中和性表位激发机体免疫应答,诱导PA特异性抗体、表位特异性抗体及中和性抗体产生的变化特点及规律。结果显示,在两种动物模型中,抗PA特异性抗体与中和性抗体的滴度变化趋势基本一致,不同的是在豚鼠模型中中和性抗体滴度在加强免疫后才开始升高。对于表位特异性抗体,在小鼠模型中,出现的时间晚,升高的速度慢。而在豚鼠模型中,它的变化趋势与抗PA特异性抗体基本一致,出现早,升高快,与中和性抗体滴度的变化也一致。同样对单抗4D10也利用噬菌体随机肽库对其表位进行筛选,结果获得一致序列“NETNI”,这段序列与PA结构域3的570-574位“NATNI”基本一致。同时采取了表达PA截断突变体,分别与单抗结合的方法,确定556-579位氨基酸间包含4D10结合的位点,这与肽库筛选的结果吻合。根据肽库筛选的结果构建缺失突变体PAdelNATNI,PAdelTNI,PAdelI,结果发现其中只有PAdelI能够与4D10呈微弱结合。进一步验证“NATNI”是这株单抗识别的关键氨基酸位点。本研究中并没有发现这株单抗在毒素作用过程中具体干涉的步骤,但是单抗协同实验的结果表明它能够增强其他单抗的中和活性。利用软件Accelrys Discovery Stdio对该表位在PA prepore晶体结构中的位置进行分析。结果显示,与表位序列相距7A的氨基酸均位于自身单体结构中,主要分布在548-581位氨基酸之间。说明该表位较独立与其他结构域无明显关系。虽然并没有找到有效的方法验证这种协同作用的原因,但是单抗协同实验的结果说明4D10所识别的表位在毒素作用过程中确实有着一定的意义。针对PA结构域4的单抗选择中和活性较高的4B2进行了噬菌体随机肽库筛选。结果获得了一致性的序列“PLYISN#N”,这与PA中686-693位氨基酸“PLYISNPN”基本一致。为了进一步证实,于是用表达不同长度的PA截断突变体,分析单抗的结合位点,结果发现所有的截断突变体都不能与单抗4B2结合,这与之前噬菌体随机肽库筛选结果并不一致,说明这株单抗的识别表位也存在构象部分。根据噬菌体筛选结果设计了缺失突变体PAdelPL,PAdelYI,PAdelSNPN,进一步分析突变体的单抗结合活性,结果显示686-689位氨基酸“PLYI”是两种单抗结合表位的关键氨基酸,而690-693位氨基酸“SNPN”仅是单抗4B2识别表位的关键位点。国内外的研究表明PA的682N和683D在PA与受体的结合中起着至关重要的作用,因此利用实验室已经构建的突变体PAD683A,PAD683N,PAN682D,PAN683A,检测其单抗结合活性,结果发现PAN682D和PAN683A均不能和单抗482、4F12结合,由此推断682位氨基酸可能是这两株单抗结合表位的关键位点。因此推测PA结构域4的4β₈-4β₉ loop中也存在一个主要的中和性表位。通过PA与受体结合实验证实识别结构域4的单抗482和4F12能够抑制PA与受体的结合,切断了毒素致病途径中的起点。从PA的晶体结构来看,PA domain4是一个相对独立的球状实体,与其他结构域的相互作用较少。目前已经明确PA domain4的4β₈-4β₉ loop在PA与受体结合的过程中起至关重要的作用,因此可以推断该中和性表位在毒素作用的起始步骤中有着重要的意义。本研究获得了多株针对PA不同结构域的中和性单抗,一方面可以发展成为抗毒素药物,另一方面也为研究毒素作用机理提供了有力工具;在PA结构域2、3、4均存在优势中和性表位,分析表明这些中和性表位与毒素作用机制密切相关;探讨了中和性表位特异性抗体的动态变化对PA保护性免疫的意义,为发展新型疫苗（表位疫苗）提供了依据。