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本论文的内容由两部分研究工作组成。
第一部分工作为人源NESCA蛋白RUN结构域的晶体结构和功能研究。
NGF是一种对于神经元细胞的增殖、分化和凋亡发挥关键的调节作用的神经生长因子。NGF信号通路一直是生物界的研究热点之一。NGF在体内有两类受体从而介导两条信号通路,即TrkA受体信号通路和P75NTR受体信号通路。
NESCA是新发现的一种可以在NGF信号通路中发挥重要作用的信号适配器蛋白,由N端RUN结构域,WW结构域,亮氨酸拉链,C末端的SH3结构域和许多高脯氨酸区组成。我们利用单波长反常散射法(SAD)解析了人源NESCA蛋白N端RUN结构域的分辨率为2.0(A)的晶体结构,证明该结构与RPIPX、Rab6IP1的RUN结构基本相同,均是由多个α螺旋组成的全螺旋三维构象。而RPIPX、Rab6IP1都是GTPase结合蛋白,其RUN结构域分别可以与Rap2,Rab6相互作用。NESCA蛋白RUN结构域与这两个蛋白结构上的主要差别位于α1’、L2、L3和α8处,这种差别的生物学意义还在进一步研究中。
我们用BIAcore的手段首次证明了NESCA-RUN可以与GTPase家族蛋白Ras相互作用,同时与TrkA具有较强的结合力,而且与Ras的结合并不影响NESCA-RUN进一步结合TrkA蛋白。这充分说明NESCA-RUN在NGF信号通路中发挥重要的信号传递作用,从而为进一步理解整个NGF信号通路,提供了新的证据。
第二部分为重组产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶的晶体结构解析。
β-葡萄糖苷酶(β-glucodisases,3.2.1.21),在各种生物有机体内都有发现,它是一种可以从非还原端水解糖基配体和寡糖的糖苷键释放出葡萄糖残基的酶类。其功能包括微生物的生物质转化,动物体内糖脂和外源苷的分解,植物细胞壁内寡糖的木质化及糖代谢等等。β-葡萄糖醛酸苷酶是生物转化甘草酸的关键酶。其中产紫青霉菌β-葡萄糖醛酸苷酶可以定向催化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸,但重组大肠杆菌表达的该酶PGUS-E后却失去了其定向性转化。
我们成功解析了E.coil表达的重组蛋白(文中统一称PGUS-E)分辨率为3.1(A)的晶体结构,同时通过序列及结构比对,推测了该重组酶的活性位点并得到实验验证。这对于从分子水平揭示产紫青霉PGUS与底物识别及其定向转化甘草酸的机制具有重要意义,同时为糖苷酶的定向设计与工程改造提供了一定的理论依据。