近年来大量研究表明,肾脏足细胞损伤与蛋白尿的发生关系密切,在许多肾小球疾病如微小病变肾病(minimal change nephropathy, MCN)、局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)、膜性肾病(membranous nephropathy, MN)、狼疮性肾炎(lupus nephritis, LN)和糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)等疾病中都发现存在足细胞损伤。参与足细胞损伤的机制包括：1)细胞骨架破坏；2)裂孔隔膜成分异常；3)线粒体功能障碍；4)核内转录因子的异常；5)细胞内钙离子稳态失衡等。钙离子(Ca2+)作为第二信使,参与调节细胞的分泌、兴奋／收缩偶联、基因转录、细胞运动、增殖和凋亡等许多生理和病理生理过程。在足细胞中,Ca2+参与足细胞肌动蛋白动力学的调节,钙信号异常可引起足细胞裂孔隔膜蛋白和(或)骨架蛋白的改变,从而影响细胞骨架的稳定性,导致细胞骨架重排、足突融合。因此,钙稳态对足细胞正常功能的维持非常重要,而细胞内钙稳态的维持依赖于细胞膜上的Ca2+内流通道、钙泵以及细胞内钙库上的Ca2+释放通道。目前已知,Ca2+内流进入细胞内主要通过三类Ca2+通道,即电压门控通道(voltage-gated Ca2+channels, VGCC)、受体门控通道(receptor-operated channels, ROC)和钙库操纵的钙通道(store-operated Ca2+ Channels, SOC)。既往研究显示,瞬时受体电位阳离子通道6(transient receptor potential cation channel 6, TRPC6)和TRPC5是介导足细胞Ca2+内流的重要通道,TRPC6基因突变可导致大量蛋白尿,引起家族性遗传性FSGS,敲除TRPC5基因可抑制脂多糖介导的足细胞骨架重排、蛋白尿的发生,保护肾脏的滤过功能。TRPC5和TRPC6均属于ROC,而SOC是非兴奋性细胞胞外Ca2+内流的主要通道,SOC及其信号分子在足细胞损伤中的作用尚不清楚。基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)是SOC通道的重要信号分子,属于Ⅰ型跨膜蛋白,主要位于内质网膜上,是内质网Ca2+浓度感受器。当内质网钙库排空后,STIM1感受到内质网内钙离子浓度的下降,即发生聚集并转位至内质网膜和细胞膜连接处,将信息传递给胞膜上的Orail蛋白,介导SOC通道开放,引起胞外Ca2+内流,从而补充胞浆和钙库中的C1t.2+。研究表明,在HEK293等细胞中通过RNAi敲低STIMl表达,可观察到明显减少的SOC电流；相反,如果过表达,则检测到增加的SOC电流。将STIM1的N端突变,导致其不能感受钙库中Ca2+浓度,不能随钙库的清空而发生聚集、激活钙通道,从而引起细胞内钙稳态的失衡。STIM1参与多种疾病过程,如肿瘤、免疫性疾病、糖尿病等,2009年Picard等在《新英格兰医学杂志》上报道了一个患有家族同源性联合免疫缺陷病的家族中,有两个孩子存在细胞内钙浓度感受器STIMl基因纯合突变,一个孩子除有严重的联合免疫缺陷表现外,还因严重的药物抵抗性肾病综合征而死亡,这提示STIM1可能在足细胞损伤机制中发挥一定作用。最近的报道提出高糖环境可显著增强肾小球系膜细胞钙库操纵的钙内流(store-operated Ca2+ entry, SOCE)及SOC信号分子STIM1的表达,而关于SOC信号与足细胞之间的研究尚未见相关的报道。本课题组成员前期实验结果显示线粒体功能障碍是足细胞损伤的早期事件,阻断线粒体功能障碍可减轻醛固酮诱导的蛋白尿及足细胞损伤。已有研究表明,STIM1参与线粒体的形状及生物能量学的调节,在氧化应激中发挥作用。在神经元细胞中,敲低STIM1表达可减轻细胞内钙超载,保护线粒体膜电位,减轻内质网应激和线粒体功能障碍,抑制氧化应激损伤和细胞凋亡。越来越多的证据表明,足细胞与神经元具有相似性,如二者具有某些类似的细胞表型和形态结构,而STIM1在足细胞中是否具有类似作用尚有待进一步研究。综上可见,STIM1原发或继发的异常表达可引起细胞内钙稳态失衡和线粒体功能障碍、氧化应激,而细胞内钙稳态失衡、线粒体功能障碍、氧化应激可引起足细胞损伤及肾小球疾病的发生。此外,足细胞相关蛋白(包括裂孔隔膜蛋白和细胞骨架蛋白)在足细胞损伤中发挥重要作用。因此,我们提出设想：STIM1的异常表达可诱导足细胞钙稳态失衡、足细胞相关蛋白表达或功能改变以及线粒体功能障碍、氧化应激,从而引起足细胞损伤。本研究首先探讨STIM1在损伤的足细胞、肾病动物模型及FSGS患者肾脏组织中的表达情况,然后在此基础上,在细胞水平进行上调或下调STIM1分子的表达,从基因过表达与低表达两个角度探讨STIM1在足细胞损伤中的作用,为深入认识和理解钙信号与足细胞损伤之间的关系奠定良好的实验基础,为阐明肾脏疾病的发病机制以及临床诊治寻求新的思路和靶点。第一部分STIMl在损伤的足细胞、肾病动物模型及FSGS患儿肾组织中的表达目的：探讨STIM1在损伤的足细胞、肾病动物模型及FSGS患儿肾脏组织中的表达。方法：体外培养条件永生化的小鼠足细胞系MPC5,应用阿霉素(adriamycin,Adr)刺激,建立足细胞损伤的细胞模型；建立Adr肾病小鼠模型和嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside, PAN)肾病大鼠模型,对照组为正常的小鼠／大鼠；临床收集FSGS.MCN患儿肾活检组织,对照组为肾脏肿瘤患者手术切除的瘤旁正常组织。采用real-time RT-PCR、western blot法分别检测STIM1的mRNA和蛋白表达；采用免疫组化法检测肾组织STIM1的表达及定位。结果：(1)细胞水平：采用Adr刺激24h后足细胞STIM1的mRNA和蛋白表达升高,且呈浓度依赖性升高,当Adr浓度达250ng//ml时起差异具有统计学意义,此时STIM1的mRNA表达约为对照组的4.62倍。(2)动物模型水平：Adr肾病小鼠模型及PAN肾病大鼠模型的肾组织中STIM1的mRNA和蛋白表达均较正常对照组明显增加。Adr肾病小鼠模型组于造模后第3天STIM1的mRNA水平已升至对照组的2.68倍,随着造模时间推移,STIM1表达略有下降,但仍显著高于对照组,至造模后第5周时仍可达对照组的2.36倍。Adr肾病小鼠模型STIM1蛋白表达为对照组的2.02倍。PAN肾病大鼠模型STIM1的mRNA和蛋白表达水平分别为对照组的3.85倍、2.25倍。免疫组化结果显示在正常的小鼠和大鼠肾皮质中STIM1主要表达于肾小球和肾间质血管,而肾小管表达较弱,肾病模型组STIM1的表达较正常对照组显著增强。(3)FSGS患儿肾组织中的表达：正常人肾皮质中STIM1主要表达于肾小管上皮细胞、肾间质血管,MCN患者肾活检组织中STIM1的表达改变不显著,而FSGS患者肾小管和肾小球STIM1的表达明显增强。结论：(1)正常情况下,STIM1在小鼠、大鼠的肾皮质中主要分布于间质血管、肾小球,而肾小管表达相对较弱；在正常人的肾皮质中则主要分布在间质血管、肾小管上皮细胞,肾小球表达相对较弱。(2)足细胞损伤的病理条件下,如阿霉素刺激的小鼠足细胞、Adr肾病小鼠模型、PAN肾病大鼠模型以及FSGS患者肾组织中STIM1的表达呈显著升高趋势,提示STIM1在足细胞损伤过程中可能发挥一定的作用。第二部分STIM1撮达诱导足细胞损伤的机制目的：建立足细胞过表达STIM1模型,检测过表达STIM1对足细胞损伤和内质网应激相关分子表达、线粒体功能的影响。方法：构建STIM1真核表达质粒载体(p-STIM1),采用双酶切、PCR和测序的方法进行鉴定。体外培养小鼠肾脏足细胞(MPC5),瞬时转染重组质粒p-STIM1或空质粒载体Vehi,24h后加入阿霉素(Adr,250ng/ml)作用24h-48h。实验分组：空载体组(Vehi)、过表达STIM1组(p-STIM1)、空载体+Adr组(Vehi+Adr)、过表达STIM1+Adr组(p-STIMl+Adr)。采用real-time RT-PCR和western blot法检测STIM1、足细胞相关分子podocim、α-actinin-4、TRPC6、内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)、 GRP94、CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein, CHOP)的表达；应用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平；Fluo-3/AM荧光探针检测足细胞胞浆Ca2+浓度；透射电镜观察足细胞线粒体形态的变化；JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane poteintial, MMP);2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸探针(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)检测足细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成；real-time PCR检测线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的拷贝数。结果：(1)双酶切、PCR及测序结果证明STIM1真核表达载体构建成功。(2)转染后的足细胞STIM1的mRNA及蛋白表达较正常对照组显著增高,分别为对照组的3.50倍、1.92倍(p<0.05),证明足细胞过表达模型建立成功。(3)过表达STIM1组的细胞凋亡增加,约为对照组的1.23倍,podocin mRNA表达下降49.8%,蛋白表达下降60%,α-actinin-4 mRNA表达升高73%,蛋白表达升高85%(p<0.05),TRPC6表达无显著改变(p>0.05)；与Vehi+Adr组比较,p-STIM1+Adr组细胞凋亡明显增加,约为Vehi+Adr组的1.44倍(p<0.05)。(4)与Vehi组比较,过表达STIM1组的足细胞胞浆内Ca2+浓度增加了23%; Vehi+Adr组增加46%；p-STIM1+Adr组增加80%,是Vehi+Adr组的1.23倍(p<0.05)。(5)与Vehi组比较,p-STIM1组细胞GRP78、GRP94、CHOP的mRNA及蛋白表达均略有上调,但差异不具有统计学意义(p>0.05)；与Vehi+Adr组比较,p-STIM1+Adr组细胞GRP78、GRP94和CHOP的mRNA表达上调,分别是对照组的1.33倍、1.26倍和1.55倍,蛋白水平分别是对照组的1.17倍、1.18倍和1.23倍(p<0.05)。(6)透射电镜下可见过表达STIM1组的足细胞线粒体形态发生改变,表现为肿胀、线粒体嵴排列紊乱,部分呈管状；Adr刺激组线粒体形态改变显著,发生空泡样变,而p-STIM1+Adr组则的线粒体形态改变更为明显。与Vehi组比较,p-STIM1组MMP和mtDNA拷贝数分别降低了30%和18%,细胞内ROS生成增加,是对照组的2.16倍；与Vehi+Adr组比较,p-STIM1+Adr组MMP和mtDNA拷贝数分别降低了22%和48%,细胞内ROS生成增加,是对照组的1.44倍(p<0.05)。结论：过表达STIM1可通过引起胞浆钙超载,影响足细胞相关分子podocin和a-actinin-4的表达,促进细胞凋亡、内质网应激及线粒体功能障碍的发生,进而引起足细胞损伤。第三部分 敲低STIM1表达抑制阿霉素诱导的足细胞损伤目的：探讨敲低STIM1的表达在阿霉素诱导的足细胞损伤中的作用。方法：体外培养小鼠肾脏足细胞MPC5,瞬时转染STIM1-siRNA,再分别加入Adr (250ng/ml)24h～48h。分组如下：阴性对照组(negative control, NC)、STIM1低表达组(si-STIM1)、Adr组(NC+Adr)、STIM1低表达+Adr组(si-STIMl+Adr)。应用real-time RT-PCR和western blot法检测STIM1、足细胞相关分子podocin、 a-actinin-4、TRPC6的表达及内质网应激相关分子GRP78、GRP94、CHOP的表达；流式细胞仪检测细胞凋亡水平；应用Fluo-3/AM荧光探针检测胞浆Ca2+浓度；透射电镜观察足细胞线粒体形态的变化；JC-1染色法检测MMP；应用DCFH-DA检测细胞内ROS的生成；real-time PCR检测mtDNA拷贝数。结果：(1)足细胞转染siRNA-STIM1后,STIM1的mRNA和蛋白的表达显著降低,分别为对照组的49%、63%(p<0.05)。(2)与NC组相比较,低表达STIM1组(si-STIM1)足细胞podocin的mRNA及蛋白表达分别降低20%、30%(p<0.05),a-actinin-4、TRPC6表达无显著改变(p>0.05)；与NC+Adr组相比,si-STIM1+Adr组足细胞podocin的mRNA表达降低30%,但蛋白水平无显著差异,a-actinin-4. TRPC6表达无显著变化(p>0.05)。与NC+Adr组相比,si-STIMl+Adr组细胞凋亡减少33%(p<0.05)。(3)与NC组比较,敲低STIM1表达组细胞胞浆内Ca2+浓度降低15.6%,但差异无统计学意义；与NC+Adr组比较,si-STIM1+Adr组胞浆Ca2+浓度降低24%(p<0.05)。(4)与NC+Adr组比较,si-STIM1+Adr组细胞GRP78、GRP94、CHOP的mRNA表达分别降低了19.6%、20.1%、27.0%(p<0.05),蛋白水平分别降低了32%、14.5%、27.9%(p<0.05)。(5)透射电镜下观察细胞,NC+Adr组的足细胞线粒体出现肿胀、线粒体棘融合断裂、空泡样改变,si-STIM1+Adr组细胞线粒体无显著的空泡样改变,仍可表现出接近正常的线粒体形态。与NC+Adr组比较,si-STM1+Adr组细胞MMP、mtDNA下降程度减轻,分别为NC+Adr组的1.26倍和1.77倍；细胞内ROS生成减少,约为NC+Adr组的76.3%(p<0.05)。结论：敲低STIM1的表达可通过减轻胞浆钙超载,阻断足细胞内质网应激、线粒体功能障碍,减少足细胞凋亡,从而减轻阿霉素诱导的足细胞损伤。但敲低STIM1对足细胞相关分子podocin的表达仍有一定影响,其具体机制尚值得进一步探讨。