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目的:甲状腺激素(Thyroid hormones,THs)的化学本质是一种酪氨酸碘化物,它参与了机体很多很重要的生理过程,在动物的生长发育过程中发挥着重要作用。THs缺乏会引起一系列生理水平的异常以及病变,其中很重要的一部分就是影响脑细胞的正常增殖和分化,从而影响大脑功能,造成脑部相关的疾病。同源盒基因NKx6.1(NK6 homeobox 1)首先发现在胰腺β细胞中表达,后来发现其在中枢神经系统的分化发育过程中起到重要作用。有实验研究表明刚出生大鼠的Nkx6.1基因的表达水平会因为母鼠喂食低碘粮而发生显著改变。本研究从甲状腺激素经典的基因组功能和非经典的非基因组功能两个方面来研究甲状腺激素对同源盒基因NKx6.1的调控机制。为进一步研究同源盒基因Nkx6.1在甲减模型的具体作用机制方面奠定基础。方法:1本实验利用实时定量PCR和Western Blotting技术在体外以星形胶质细胞为载体检测甲状腺激素对同源盒基因NKx6.1表达的影响。正常培养细胞在用不含血清和双抗的RPMI1640培养基培养24小时进行脱激素处理之后,实验分组为低激素组:血清替代物和双抗的RPMI1640培养基培养,正常组:5%血清和双抗的RPMI1640培养基培养,高激素组:正常组培养基中加入终浓度10-7MT3的培养基培养。每种处理分三个时间段进行培养,分别为12h,24h和48h。提取细胞总RNA和蛋白,利用实时定量PCR技术和Western Blotting检测NKx6.1表达水平。2用PCR扩增大鼠脑组织NKx6.1的5’上游启动子片段2.4 kb,应用生物信息学方法预测该片段上潜在的转录因子T3R结合位点,根据不同的结合位点作系列截短,获得3段长度不等的启动子缺失片段,分别克隆到荧光素酶报告基因表达质粒(pGL3-Basic)上,构建相应的报告载体。将报告载体和T3R共转染大鼠星形胶质细胞(Rat Astrocytes,RA),并检测报告基因荧光素酶的活性。3利用Western Blotting以正常培养的星形胶质细胞为对照检测高激素培养的星形胶质细胞中Shh信号通路下游因子Gli1,PI3K/AKT信号通路磷酸化产物p-AKT和MAPK信号通路磷酸化产物p-ERK的表达水平的变化,来验证甲状腺激素对Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路是否有激活作用。用抑制剂分组处理Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路,利用Western Blotting检测抑制后Gli1、p-AKT和p-ERK的表达情况,来确定Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路之间是否存在交叉调控以及串并联关系。结果:1实时定量PCR和Western Blotting结果显示对比于正常组,低激素组在48h表达显著下调,高激素组在12h和24h表达上调,48h表达下调。2扩增NKx6.1第一个外显子的起始密码子的5’上游2325bp启动子片段。根据JASPAR在线预测转录因子T3R结合位点作系列截短,成功构建三个NKx6.1系列截短启动子报告载体pGL3-2.3,pGL3-1.8,pGL3-1.5,pc DNA-T3R对pGL3-2.3与pGL3-1.8的激活作用相当,而对pGL3-1.5的激活作用显著下降(P<0.05)。3Western Blotting结果显示,高激素培养的细胞中Gli1、p-AKT的表达均升高。在抑制MAPK信号通路时,Gli1、p-AKT的表达没有显著变化,在抑制PI3K/AKT信号通路时Gli1的表达下降,p-ERK的表达没有显著变化,在抑制Shh信号通路时p-AKT、p-ERK的表达没有显著变化。结论:1甲状腺激素对同源盒基因NKx6.1的表达有诱导作用。2双荧光素酶报告基因活性检测表明T3R对NKx6.1启动子有明显调控作用,其中-1887bp~-1507bp活性最高,即存在关键顺式调控元件。3Shh信号通路可以影响甲状腺激素对同源盒基因NKx6.1的表达调控。但具体调控路径尚未搞清楚。