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苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）Cry9Ea蛋白对入侵生物美国白蛾(Hyphantria cunea)具有较好的杀虫活性。为了确定Cry9Ea蛋白与美国白蛾中肠结合蛋白相互作用中的关键区域和位点，本研究首次通过生物信息学分析选择Cry9Ea10DomainⅢβ20-β21loop上的7个氨基酸残基位点进行丙氨酸扫描突变，获得了杀虫活性和亲和力都发生变化的突变体，第一次克隆得到美国白蛾中肠类钙黏蛋白基因，为进一步深入研究Cry9类蛋白杀虫作用机理以及探索美国白蛾中肠受体功能提供了依据。 本研究从呈现细菌感染症状死亡的美国白蛾幼虫体内分离克隆得到了新的cry9Ea基因，国际Bt命名委员会正式命名为cry9Ea10，构建了重组穿梭表达载体pSXY422b-9Ea10，电击转化Bt无晶体突变株HD73-，获得工程菌HD（9Ea10），高效表达130kDa的Cry9Ea10蛋白，对美国白蛾幼虫杀虫活性LC50为8.02μg/mL。同时在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了Cry9Ea10DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ三个结构域蛋白。利用在线分析工具和服务器对Cry蛋白的一级结构和二级结构进行分析并建立了蛋白质三维结构预测模型，分析发现DomainⅢ上热点残基较为聚集，对比其它Cry9类蛋白结构，Cry9Ea10DomainⅢ上的β20-β21loop呈现明显差异。对β20-β21loop上的氨基酸残基进行丙氨酸扫描突变，获得N601A、G602A、S603A、L604A、T605A、Y606A和E607A共7个突变子，均能产生130kDa的小球形晶体蛋白。 利用RACE-PCR方法获得了美国白蛾中肠类钙黏蛋白全长基因hccad-like（hccadherin-like），在HighFive细胞中表达约200kDa的HcCAD-like蛋白。同时对HcCAD-like蛋白N端Cadherin repeats CR1-CR5和近膜区Cadherin repeats CR6-MPR功能域进行了体外表达，Ligand Blot分析结果显示，Cry9Ea10蛋白能够与HcCAD-like特异结合，并且与CR6-MPR结合力较强，生物测定结果表明CR6-MPR可以增加Cry9Ea10蛋白对美国白蛾幼虫的杀虫活性。克隆并表达了美国白蛾中肠氨肽酶N4基因hcapn4及其小片段基因hcapn-mv，Ligand Blot分析结果显示，Cry9Ea10蛋白与HcAPN4特异结合并且结合区域位于GluZincin结构域上的HcAPN-MV。Cry9Ea10三个结构域蛋白与中肠结合蛋白功能域的体外结合实验表明DomainⅢ在与所有功能域结合中都起到重要作用。 对美国白蛾初孵幼虫进行生物活性测定，结果显示N601A(LC50为15.84μg/mL)和G602A（LC50为14.41μg/mL）的杀虫活性与野生型(LC50为9.40μg/mL)相比分别降低了69％和53％;S603A和T605A活性无明显变化;L604A(LC50为3.73μg/mL)、Y606A(LC50为2.87μg/mL)和E607A(LC50为2.12μg/mL)的杀虫活性则分别提高了2.52、3.28和4.44倍。 7个突变子蛋白与美国白蛾中肠结合蛋白的亲和能力分析结果显示，N601A、G602A和S603A与HcCAD-like、CR1-CR5和CR6-MPR的亲和力显著降低;L604A与HcAPN4及其N端结构域GluZincin的亲和力显著升高;Y606A与HcAPN4的结合力显著升高;E607A与HcAPN4C端结构域ERAP1_C的亲和力显著升高。突变体杀虫活性的变化与突变体亲和力变化特点具有一致性，说明突变体与中肠蛋白结合能力的改变能够影响其杀虫活性，证明DomainⅢβ20-β21loop上的N601、G602、L604、Y606和E607五个氨基酸残基位点在Cry9Ea蛋白发挥杀虫活性功能上具有重要作用。