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目的:创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)的核心特征是恐惧记忆异常。恐惧记忆异常是在安全环境中对恐惧的抑制减弱,更容易泛化的恐惧学习或无法被抑制的不适当的恐惧反应。然而目前,关于恐惧记忆异常的分子机制仍不清楚。研究表明,PTSD与大脑恐惧记忆环路脑区-海马、前额内侧皮质(medial prefrontal cortex,m PFC)和杏仁核等密切相关。Stathmin蛋白是一种广泛存在的胞浆磷蛋白,是微管不稳定性调节蛋白家族的成员,具有促进微管解聚的能力。神经细胞均具有stathmin样结构域(stathmin-like domain,SLD)。Stathmin蛋白家族可以通过自身的α-螺旋和微管α/β异二聚体之间形成紧密的三聚体T2S复合物,从而抑制微管聚合,在调节微管蛋白中起作用。当stathmin磷酸化时,T2S复合物分解,从而释放微管二聚体,并抑制stathmin与α/β微管蛋白的结合,stathmin蛋白解聚微管,从而促进微管形成和延长。磷酸化的stathmin蛋白促进微管聚合,而去磷酸化的stathmin促进微管解聚。因此,stathmin蛋白家族的磷酸化位点与其功能有着重要的关系。Stathmin蛋白的下游作用靶点是微管蛋白,稳定微管的一类蛋白是微管结合蛋白(microtubule associated protein,MAP),微管二聚体能与MAP相结合,从而稳定微管。研究发现stathmin参与恐惧记忆的调控,那么stathmin及其磷酸化异常是否与由PTSD引起的恐惧记忆异常相关联?本文通过单一连续应激(single prolonged stress,SPS)建立PTSD大鼠模型,采用免疫组织化学、western blotting、q RT-PCR等方法检测stathmin、p-stathmin、β-tubulin和MAP-1B在PTSD大鼠恐惧记忆环路脑区-海马、m PFC和杏仁核SPS后1天,4天,7天,14天的表达情况,探讨stathmin、p-stathmin、β-tubulin和MAP-1B在PTSD大鼠海马、m PFC和杏仁核中不同时间变化情况。阐明stathmin等参与PTSD的恐惧记忆异常的分子机制,为寻找PTSD有效治疗药物的新靶点提供实验依据。研究方法:1.实验动物分组:将175只Wistar大鼠随机分为5组:⑴正常对照组(Control组);⑵SPS 1 d组;⑶SPS 4 d组;⑷SPS 7 d组;⑸SPS 14 d组。每组35只。2.建立大鼠PTSD模型:实验动物采用2005年于日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的SPS方法建立大鼠PTSD模型。在设定的时间节点,对实验大鼠进行取材及相应检测。3.免疫组织化学染色:采用SABC法对各组大鼠大脑切片进行免疫组织化学染色,检测stathmin、β-tubulin和MAP-1B在各组大鼠海马、m PFC和杏仁核的形态学表达情况,应用Meta Morph/DPIO/BX41形态图像分析系统计算每个视野中染色细胞的单位阳性面积光密度值,并进行半定量分析。4.Western blotting技术:采用Western blotting方法检测stathmin、p-stathmin(Ser16)、p-stathmin(Ser25)、p-stathmin(Ser38)、p-stathmin(Ser63)、β-tubulin和MAP-1B蛋白在各组大鼠海马、m PFC和杏仁核的表达变化,用凝胶图象处理系统分析目标蛋白(stathmin等)条带和内参(GAPDH)条带的净光密度值。并以各组样品stathmin等/GAPDH的光密度比值来观察stathmin等蛋白的相对表达变化,进行半定量分析。5.q RT-PCR技术:采用q RT-PCR方法检测各组大鼠海马、m PFC和杏仁核stathmin、β-tubulin和MAP-1B m RNA的表达变化。q RT-PCR以GAPDH为内参照,对目标基因进行归一化处理,并应用2-ΔΔCt法来比较每组样品中stathmin、β-tubulin和MAP-1B m RNA的相对表达量的差异。6.实验所得数据以均值±标准差表示。使用SPSS 19.0统计学软件进行分析,各组数据资料采用单因素方差分析进行统计处理,采用t检验比较两组数据间差异。认为P<0.05的水平具有统计学意义。结果:1.Stathmin在PTSD大鼠海马、m PFC和杏仁核表达结果:免疫组织化学染色显示,stathmin阳性表达呈棕黄色颗粒,主要分布在大鼠海马、m PFC和杏仁核神经元胞体中。正常对照组中,大鼠海马、m PFC和杏仁核神经元中stathmin的表达较强。SPS后1天和4天,stathmin的表达逐渐减少,在第7天表达最少,然后逐渐增多。Western blotting检测正常对照组和SPS各组大鼠海马、m PFC和杏仁核中stathmin蛋白表达,与正常对照组相比,stathmin蛋白表达于SPS1 d组、SPS 4 d组逐渐下降,SPS 7 d组表达最低,并于第14 d恢复与正常组水平。q RT-PCR检测分析结果显示,SPS 1 d组和SPS 4 d组stathmin m RNA水平较正常对照组降低,SPS 7 d组达到最低,之后恢复。2.p-stathmin(Ser16)、p-stathmin(Ser25)、p-stathmin(Ser38)和p-stathmin(Ser63)在PTSD大鼠海马、m PFC和杏仁核的表达结果:采用Western blotting检测正常对照组和SPS各组大鼠海马中p-stathmin(Ser16)、p-stathmin(Ser25)、p-stathmin(Ser38)和p-stathmin(Ser63)蛋白表达结果显示,p-stathmin(Ser25)、p-stathmin(Ser38)蛋白表达于正常大鼠海马中。SPS 1 d后,p-stathmin(Ser25)、p-stathmin(Ser38)蛋白表达水平均逐渐增加,于第7 d达到高峰,随后下降。而p-stathmin(Ser16)和p-stathmin(Ser63)在正常对照组和SPS各组中均没有表达。Western blotting检测大鼠m PFC p-stathmin(Ser16)、p-stathmin(Ser25)、p-stathmin(Ser38)和p-stathmin(Ser63)蛋白在正常对照组和SPS各组大鼠m PFC中表达结果显示,与正常对照组相比,p-stathmin(Ser63)蛋白表达逐渐增加,于SPS 7d时达到高峰,随后减少。而p-stathmin(Ser16)、p-stathmin(Ser25)和p-stathmin(Ser38)在各组中均没有表达。3.β-tubulin和MAP-1B在PTSD大鼠海马、m PFC和杏仁核表达结果:β-tubulin的免疫反应阳性蛋白为神经元树突、轴突和胞体中表达呈黄色颗粒物质。在正常对照组,β-tubulin在大鼠海马神经元中阳性表达染色较浅。在SPS 1 d后,β-tubulin阳性表达升高,SPS 7 d时表达最高,随后减少。Western blotting检测β-tubulin和MAP-1B在正常对照组和SPS各组大鼠海马中表达。β-tubulin蛋白表达于SPS 1 d后逐渐增加,于7 d达到峰值,随后减少。而MAP-1B蛋白表达于SPS 1d组达到峰值,SPS 4 d组降到最低,之后逐渐增加。采用q RT-PCR检测β-tubulin m RNA和MAP-1B m RNA在正常对照组和SPS各组大鼠海马中表达结果,SPS 4 d组和SPS 7 d组β-tubulin m RNA表达水平较正常对照组显著升高;MAP-1B m RNA表达水平在SPS 1 d后逐渐升高,于7 d达到高峰,随后下降。免疫组织化学染色显示β-tubulin和MAP-1B的免疫反应阳性蛋白表达于m PFC神经元胞体及树突、轴突中,呈黄色颗粒物质。在正常对照组,β-tubulin和MAP-1B在大鼠m PFC神经元中阳性表达染色较浅。在SPS 7 d,β-tubulin和MAP-1B阳性表达最多,随后减少。Western blotting检测大鼠m PFCβ-tubulin和MAP-1B在正常对照组和SPS各组大鼠m PFC中表达结果显示,与正常对照组相比,β-tubulin和MAP-1B蛋白表达均逐渐增加,于SPS 7 d时达到高峰,随后减少。采用q RT-PCR检测β-tubulin m RNA和MAP-1B m RNA在正常对照组和SPS各组大鼠m PFC中表达结果显示,SPS 7 d组β-tubulin m RNA表达水平较正常对照组显著升高。大鼠m PFC中MAP-1B m RNA表达水平在SPS 1 d后逐渐升高,于SPS 7 d达到峰值,随后下降。Western blotting检测β-tubulin和MAP-1B在正常对照组和SPS各组大鼠杏仁核中表达结果显示,与正常对照组相比,β-tubulin和MAP-1B蛋白表达均逐渐增加,于7 d达到峰值,随后减少。采用q RT-PCR检测β-tubulin m RNA和MAP-1B m RNA在正常对照组和SPS各组大鼠杏仁核中表达结果显示,SPS 7 d组β-tubulin m RNA水平较正常对照组显著升高。MAP-1B m RNA表达水平在SPS 1 d后逐渐升高,于SPS 7 d达到高峰,随后下降。结论:1.SPS引起PTSD大鼠恐惧记忆环路脑区-海马、m PFC和杏仁核stathmin的改变,从而影响微管稳定性,可能调控PTSD大鼠恐惧记忆异常。2.PTSD大鼠海马p-stathmin(Ser25)和p-stathmin(Ser38)的磷酸化可能参与微管稳定性调节作用。3.Stathmin-β-tubulin在SPS引起PTSD大鼠恐惧记忆环路脑区-海马、m PFC和杏仁核结合的双相变化,为微管稳定性变化提供依据。4.本实验的研究结果证实在SPS引起的PTSD过程中,MAP-1B参与调节微管稳定性。