增生性瘢痕(Hypertrophic Scar,HS)属病理性的瘢痕。过去采用的治疗方法如手术、物理、激光、药物等疗效均不理想,都存在某种程度的缺点和副作用,使得临床上缺乏真正理想的防治方法。5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-Aminolevulnilic Acid photodynamic therapy,ALA-PDT)是80-90年代兴起的,利用物理原理对恶性肿瘤治疗效果明显的局部治疗新技术。研究显示,ALA-PDT作用是根据5-氨基酮戊酸(5-AminolevulnilicAcid,ALA)的最佳浓度联合最佳激光能量密度,对体外培养的人瘢痕成纤维细胞(Fibroblast,Fb)的增殖起到显著抑制作用,其机制可能与ALA-PDT降低Fb的活性及增加成纤维细胞的自噬能力有关。而Fb的增殖能力强、功能活跃,为摄取更多的光敏剂提供条件。因此,我们推测ALA-PDT疗法可能成为治疗增生性瘢痕的一种有效的新手段,但其作用机制及临床使用的有效性尚待进一步研究。目的:以体外培养的人(瘢痕)成纤维细胞为实验对象,利用ALA-PDT对成纤维细胞进行干预,观察ALA组、激光组、ALA-PDT组与空白组(正常皮肤组织成纤维细胞、瘢痕组织成纤维细胞)对Fb增殖与凋亡情况的影响。此外,通过分子生物学方法,监测Fb相关的细胞外基质蛋白(α-SMA、VEGF、TGF-β、FGF2)胶原含量及表达情况,根据实验结果对ALA-PDT抑制成纤维细胞的作用机制进行阐述,同时为增生性瘢痕形成的分子机制提供理论依据,也为临床防治增生性瘢痕的形成提供新思路。方法:(1)收集来自于确诊患者的增生性瘢痕组织,采用分离培养法培养成纤维细胞,用第5-8代的成纤维细胞作为研究对象;(2)利用MTT法检测,不同 ALA 浓度(0、0.015、0.15、1.5、15、150、1500mmol/l)孵育 HSFb 及不同激光能量密度(5、10、50、100、150J/cm2)照射HSFb的吸光值(Optical Density,OD),根据实验结果,观察以上两种干预手段对Fb增殖率的影响;(3)利用MTT法检测ALA-PDT对Fb增殖抑制程度,从而找出ALA-PDT对Fb增殖抑制效果最佳的药物作用浓度及激光照射密度;(4)根据前期实验结果,利用最佳药物浓度及激光照射密度作用于人(瘢痕)成纤维细胞,通过流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况;(5)收集细胞上清液,利用ELISA检测α-SMA、TGF-β、VEGFA及FGF2的胶原含量;(6)利用蛋白质印迹法(Western-Blot)检测细胞中α-SMA、VEGFA、TGF-0及FGF2蛋白的表达情况。结果:1、增生性瘢痕Fb培养结果,见成熟的HSFb细胞形态呈梭形或者不规则形,细胞与细胞的长突起之间相互交联生长,胞浆均匀丰富,细胞核呈类圆形或圆形。2、ALA-PDT作用人(瘢痕)成纤维细胞后,激光照射密度在30 J/CIcm2以下,光敏剂ALA的浓度在1.0 mmnol/L以下,对成纤维细胞的增殖抑制作用无明显统计学意义(P>0.05)。3、当激光照射密度(≥50 J/CIcm2)联合ALA孵育浓度(≥2.0mmol/L)时,与相同浓度的药物组或相同能量激光组相比,抑制率明显增加(P<0.05)。4、流式细胞术测定,在ALA(2.0mmol/L)、激光照射密度(≥50J/cm2)时,对Fb凋亡及细胞周期的影响结果显示,ALA-PDT组与瘢痕对照组比较,早期凋亡和晚期凋亡明显增加。此外,ALA-PDT组抑制S期作用明显高于瘢痕对照组和单独使用ALA组或激光组,显著抑制细胞周期进展。5、ELISA测定结果显示:ALA-PDT对Fb外基质蛋白中α-SMA、TGF-β1、VEGFA及FGF2等蛋白的胶原含量明显下降,与瘢痕对照组,单独ALA组、单独激光组比较差异有统计学意义。6、Western Blot 测定结果显示:ALA-PDT 对 HSFb 中 α-SMA、VEGF、TGF-β 及 FGF2等蛋白表达与瘢痕对照组,单独ALA组、单独激光组比较,抑制作用有明显统计学差异。结论:1、本实验得出ALA浓度2.0mmol/L,激光照射剂量50J/cm2作为ALA-PDT对Fb干预的最佳药物浓度及激光照射密度。2、ALA-PDT疗法在体外培养体系中可明显抑制α-SMA、VEGFA、TGF-β及FGF2的胶原含量和表达;3、ALA-PDT疗法对HSFb有明显的抑制增殖,促进凋亡作用,为临床上ALA-PDT治疗增生性瘢痕提供了新的思路和途径。