糖的合成不依赖于模板,由一系列酶催化形成的糖链其数目、种类、结构各不相同。糖基化修饰的蛋白质被称为糖蛋白,细胞膜和细胞外基质中糖蛋白含量丰富,能够介导细胞正常的生理过程,如细胞的生长、分化,细胞间的识别等。蛋白质糖基化的紊乱可能导致许多病理过程,如自身免疫疾病、癌症甚至不孕不育等。针对糖基化的分析有助于我们更好地了解糖介导的细胞生物学功能,基于质谱、糖芯片以及凝集素的一系列方法被广泛地应用于糖链结构及功能的研究。本课题组开发了植物凝集素芯片,并将其用于不同细胞表面的糖基化分析。但是植物凝集素有时无法满足人体中种类丰富、结构复杂的糖型分析要求。人凝集素和类人凝集素蛋白质既能够与人体中复杂的糖型较好地结合,又可以发挥一系列生物学功能。本研究主要目的是构建人凝集素芯片,并证明芯片上人凝集素和类人凝集素蛋白质的活性。从93种人凝集素和类人凝集素蛋白质编码序列的Entry clone开始,通过Gateway系统构建人凝集素蛋白质的酵母表达系统,最终表达并纯化得到60种人凝集素和类人凝集素蛋白质。通过接触式点样仪和高分子三维基片点制包含60种人凝集素和类人凝集素蛋白质的芯片。利用细胞裂解液和完整细胞证明芯片上至少有43种重组人凝集素是有生物活性的。本研究用人凝集素芯片分析人精子细胞表面糖基化。芯片分析发现,galectin-1、galectin-7、galectin-8,ERGIC-53以及GalNAc-T6能够跟精子细胞结合,它们识别的糖包括半乳糖苷类、甘露糖以及唾液酸。用流式细胞技术和荧光显微镜证明5种人凝集素跟精子细胞的结合并且结合位置不同。通过galectin-1亲和捕获和质谱研究发现,galectin-1跟精子几种细胞膜蛋白有结合,包括HSP90和HSP70、血管紧张素转化酶、Mucin-6以及Tubulinβ-4B chain。在精子体外获能和顶体反应培养液中加入galectin-8后发现,与对照相比galectin-8能够将精子顶体反应发生率提高22.7%。本课题组在植物凝集素芯片领域的研究已经超过10年,已有的芯片包含94种植物凝集素。我们深知植物凝集素芯片存在的不足,因此从芯片构建和应用流程两个方面对已有的植物凝集素芯片做了进一步的整理和完善。剔除芯片上没有活性以及功能冗余的凝集素,将芯片上的植物凝集素从94种缩减到56种。重新制备的植物凝集素芯片除了可用于细胞类样品的分析外,还可分析简单、复杂的蛋白质类的样品以及有膜结构的小泡,如IgG、卵清蛋白、人转铁蛋白、血清样本以及外泌体。另外发现,一些植物凝集素与组蛋白存在非特异性结合,因此植物凝集素芯片技术无法用来分析组蛋白糖基化。综上,本研究构建了首款人凝集素蛋白质芯片,并证明其上71.7%的人凝集素和类人凝集素蛋白有活性。分析精子细胞表面糖基化发现5种人凝集素能够跟精子结合,说明精子表面主要含末端唾液酸糖基化、半乳糖苷型的糖链以及甘露糖;同时还发现galectin-8在体外能够促进精子的获能和顶体反应。另外,本研究还对植物凝集素芯片的构建进行了进一步的完善,并优化了植物凝集素芯片分析蛋白质类样品的操作步骤。期望能够充分利用人凝集素芯片和植物凝集素芯片优势,与质谱、糖芯片等技术相结合,更好的应用于人源样品的糖组学研究。