研究背景原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC,以下简称肝癌)恶性程度高,自然生存期短,由于其发病隐匿,确诊时能够手术切除者仅占10%～20%,术后5年复发率高达70%,而单纯外科治疗一般无法从根本上解决肝癌复发的问题。临床上针对中晚期的肝癌主要以手术、介入治疗及大剂量化疗为主,但传统化疗药物的长期应用使肝癌细胞耐药现象越来越普遍,这大大影响了化疗药物的临床应用。因此,解决中晚期的肝癌化疗中的耐药问题和优化化疗方案显得尤为必要。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)属于ω-3多不饱和脂肪酸家族成员,大量研究表明,DHA能选择性杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞的影响较轻,其作用机制涉及对肿瘤细胞增殖抑制、凋亡和分化诱导,对环氧化酶的抑制和脂质过氧化的影响,对抗癌免疫功能的调节等方面。近年来研究发现,ω-3多不饱和脂肪酸不仅对多种恶性肿瘤均具有抑制作用,而且与具有明确抗癌效果的药物联合可达到增强抑瘤效应、降低化疗药物毒性和解决耐药等目的。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是消化系统恶性肿瘤的基本用药,是第一个用于肝癌治疗的系统性化疗药物,它对多种肿瘤有抑制作用。但5-FU的缺点是用药有效剂量与中毒剂量相近、药物的生物利用率低等。5-FU联合其他药物使用的效果比单独使用该药疗效要好,因此在联合化疗中应用较多。5-FU应用于联合化疗优点包括只需小剂量化疗药物就可以取得高效果,药物不良反应减少,耐药性降低,还可以降低化疗药物自身的毒性。因此,5-FU的联合化疗拥有更广阔的临床应用前景。已有文献报道,DHA可在一定程度上抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡,但DHA联合5-FU应用于肝癌细胞的抑制增殖、诱导凋亡等方面是否具有明确抗癌协同作用,尚未完全明确。同时,DHA联合5-FU诱导肝癌细胞凋亡的分子机制值得进一步探讨。因此,本研究采用CCK-8法检测DHA、5-FU两药单用和联用对肝癌细胞HepG2增殖的影响；Annexin-V-PE/PI荧光双标记法检测DHA、5-FU两药单用和联用对HepG2细胞凋亡作用；Hoechst33258染色及JC-1线粒体膜电位检测观察HepG2细胞的凋亡及形态学变化。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡与抗凋亡信号转导通路中起着关键性作用。该家族中主要的抗凋亡基因是Bcl-2,而主要的促凋亡基因是Bax。有报道指出,Bcl-2和Bax的生物学特性及其在肝癌细胞HepG2中的作用、细胞凋亡的失控是导致肿瘤发生、发展的重要方面。肿瘤的发生与细胞内信息传递异常密切相关,而肝癌细胞的增殖受多条信号转导通路影响,有丝分裂原激活激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)是信号从细胞表面到细胞核内重要传递者。MAPK信号传导通路的异常,将导致细胞增殖与凋亡之间的失衡,可能在肝癌发病过程起作用。MAPK信号通路主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, c-JNK)和p38。 ERK主要参与细胞的生长、增殖与分化,SAPK/JNK和p38主要参与炎性反应与凋亡。此外,近年来Caspases(cysteine aspartic acid specific protease)以执行细胞凋亡而受到广泛关注。在哺乳动物细胞,Caspase以依赖线粒体和非依赖线粒体两条途径促进细胞凋亡Caspase-8在其中起重要作用,是细胞凋亡的启动者,被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活,且可将凋亡信号从非依赖线粒体途径传递到线粒体途径,把死亡受体通路和线粒体通路联系起来,放大凋亡信号。因此,在研究DHA联合5-FU诱导肝癌细胞凋亡的分子机制时,采用Western Blot方法检测5-FU单用或联合DHA对HepG2细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响,进而检测MAPK、Caspase-8等蛋白表达变化,初步揭示DHA增强5-FU疗效的机制,以期利用DHA通过不同通路协同化疗药物诱导细胞凋亡的特点,为DHA与5-FU在肝癌综合治疗研究领域提供理论依据和实验室基础。目的1.DHA联合5-FU作用肝癌细胞在抑制细胞增殖、诱导凋亡等方面是否具有明确抗癌协同效果。2.探讨DHA联合5-FU诱导肝癌细胞凋亡分子的机制。方法1.CCK-8法检测细胞增殖接种处理好的单细胞悬液于96孔板,每孔100μlDMEM完全培养基含3000个细胞,每组设6个复孔,不同处理时间后,加入CCK-8溶液10μl,继续培养2h后在450nm波长下,酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线,实验重复3次,所有数据以均数±标准差(x±s)表示。2. Annexin V-PE/PI荧光双标记法检测HepG2细胞的凋亡用0.25%胰酶将细胞从培养瓶底消化下来,1200rpm离心5min,计数细胞；各组细胞以l×l05/孔接种于6孔板,每组设3个复孔；接种培养24h后,细胞密度为80%,更换培养基,各孔加入5-FU或DHA诱导细胞凋亡,48小时后,用0.25%胰酶(不含EDTA)将六孔板上的细胞消化下来,PBS洗涤细胞两次,2000rpm离心5min,收集1×105-5×105细胞；吸取500ul1×Binding Buffer加入到细胞悬液里；然后加入5μl的Annexin V-PE和10μl的PI；室温、避光,反应5-15min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。3.Hoechst33258染色及JC-1线粒体膜电位检测观察HepG2细胞的凋亡情况5-FU、DHA两药单用或联用处理细胞48小时后,固定10min。加入Hoechst33258染色液,0.3ml/孔,染色10min。倒置荧光显微镜下观察细胞核形态改变,400×视野下选择5个典型视野,每个视野计数200个细胞,计算每个视野凋亡核所占比率,记为该组细胞的凋亡率。5-FU或5-FU联合DHA处理细胞48小时后,倒置荧光显微镜下观察细胞浆内线粒体膜电位的变化,200×视野下选择5个典型视野,每个视野计数200个细胞,计算每个视野红色荧光细胞所占比率。4.Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及MAPK、Caspase-8蛋白表达变化提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,配制10%蛋白电泳分离胶和5%积层胶,蛋白变性上样,上样量30μg,按照积层胶电压70V,分离胶电压100V电泳,待溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部时停止电泳。恒压20V,30min半干电转膜,5%的脱脂奶粉/TBS-T室温封闭1h,5%的脱脂奶粉/TBS-T1：500稀释相应的一抗,与PVDF膜4℃孵育过夜,TBS-T洗涤,同样方法1：3000稀释HRP标记二抗,室温1h, TBS-T洗涤后,ECL化学发光法检测,Quantity one (Bio-Rad)软件半定量分析。5.统计学分析数据以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), Hoechst染色和JC-1荧光染色结果采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.DHA联合5-FU对肝癌细胞HepG2的增殖抑制、诱导凋亡具有协同作用：5ug/ml5-FU单独处理组及5ug/ml5-FU联合30ug/ml DHA组处理细胞24h、48h、72h后,增殖抑制率分别为：11.7±2.7%、24.4±3.9%、62.8±5.2%；13.7±2.1%、59.0±3.6%、85.3±2.7%。联合处理组细胞凋亡率较单独使用5-FU组明显增加,分别为23.74±3.20%、13.2±2.81%。Hoechst33258染色显示,5-FU联合DHA组细胞中出现明显的凋亡核表现,细胞凋亡率较单独采用5-FU及对照组细胞显著增高。JC-1线粒体膜电位检测结果显示,联合组细胞线粒体膜电位较单独使用5-FU组显著降低,提示DHA可能通过线粒体途径来诱导凋亡而增强5-FU的细胞毒效应。2.5-FU单独或联合DHA均下调肝癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达,增强Bax表达,抑制磷酸化ERK表达；5-FU联合DHA较单用5-FU对Bcl-2的抑制作用更,并能显著激活Caspase-8和JNK活性,抑制磷酸化ERK活性。Western Blot检测结果显示,与对照组比较,5-FU单独或联合DHA均下调肝癌细胞凋亡相关蛋白的Bcl-2表达；与单用5-FU比较,5-FU联合DHA组Bcl-2表达受到明显的抑制。与对照组比较,联合组与单用5-FU组的Bax表达均增强。与对照组比较,5-FU单独处理组HepG2细胞p-ERK表达下降,p-JNK、Cleaved Caspase-8表达增加,P-P38表达无变化。与单用5-FU组比较,5-FU联合DHA组对MAPK的影响,p-ERK明显受到抑制,而p-JNK表达显著增加,p-P38表达无差别；联合组Cleaved Caspase-8表达显著增加。结论DHA联合5-FU对肝癌细胞的增殖抑制、诱导凋亡具有协同作用；两药联合可能通过下调Bcl-2表达、抑制磷酸化ERK及激活JNK、Caspase-8活性来诱导肝癌细胞凋亡。