论文部分内容阅读
木薯(Manihot esculenta Crantz)是重要的热带作物,块根中富含淀粉,即可作为粮食食用,又可作为“能源植物”用于乙醇燃料的生产。干旱、低温等非生物胁迫是制约木薯稳产高产的重要因素,植物中单糖可作为渗透保护剂、抗氧化剂以及信号分子参与各种胁迫反应,而单糖的运输与分配极大程度上依赖于己糖转运蛋白(Sugar Transport Proteins,STPs)的转运活动,但STPs在植物胁迫应答中的作用尚不清楚。从木薯20个编码STP的基因中,鉴定出响应胁迫的关键基因,并对其功能的研究,有助于更全面的理解木薯在胁迫环境下生理生化的响应机制。本研究利用Real-time PCR技术分析MeSTPs在干旱与低温胁迫下的表达模式,鉴定出受干旱诱导上调表达基因MeSTP7,通过比较MeSTP7在木薯高淀粉品种KU50和高可溶性糖品种CAS36中的表达模式、亚细胞定位分析、酵母单糖突变体功能互补验证等实验,初步解析了MeSTP7的功能;此外优化完善了木薯叶肉原生质体瞬时表达体系,为后续木薯细胞生理生化特性、蛋白质亚细胞定位、基因功能等研究提供有力的工具。主要研究结果如下:1.利用25% PEG6000模拟干旱胁迫,7℃低温胁迫处理木薯材料,比较了 20个MeSTPs在两种胁迫下的表达模式。发现在干旱胁迫下:5个MeSTPs的表达无显著变化,9个MeSTPs的表达下调,2个MeSTPs的表达上调;其中MeSTP7的表达变化显著,在12 h、48 h的表达量为初始表达量的2.6倍、4.1倍。低温胁迫下:5个MeSTPs的表达无显著变化,9个MeSTPs的表达下调,2个MeSTPs的表达上调。初步确定MeSTP7参与了木薯干旱胁迫响应。2.比较MeSTP7在KU50与CAS36中的组织表达差异性与不同发育阶段叶与根中的表达模式,发现两个品种中MeSTP7具有类似的表达模式:MeSTP7主要在叶片中表达,在根与茎中的表达相对较低;MeSTP7在木薯膨大期时叶片中的表达量相对高于幼苗期与形成期,MeSTP7根发育前期时的表达量高于膨大期。不同的是,MeSTP7在CAS36中的表达显著高于KU50,暗示MeSTP7参与了单糖的积累活动。3.对MeSTP7测序后,进行生物信息学分析。其开放阅读框为1 590 bp,编码529个氨基酸,蛋白分子量为58.24 kDa,等电点为9.09,含有Sugar_tr结构域,疏水性预测结果表明MeSTP7具有12个跨膜结构域,属于主要易化超家族(Major Facilitator Superfamily, MFS );分析MeSTP7启动子序列发现其具有干旱响应元件MBS、热激响应元件HSE、脱落酸响应元件ABRE等与干旱胁迫相关的顺式作用元件。4.本研究建立了成熟木薯叶肉原生质体瞬时表达体系,结果表明:制备木薯叶肉原生质体最适宜的酶液组合为1.6 %纤维素酶和0.8 %半纤维素酶,获得原生质体的产量为4.42x107个/g FW,活力为92.60 %;使用25 % PEG4000转化10 min,木薯原生质体的转化效率最高(70.84%)。利用该瞬时表达体系对MeSTP7的定位分析发现其定位在细胞膜上,并在拟南芥叶肉原生质体瞬时表达体系中进一步验证了该结果。5.酿酒酵母单糖突变体功能互补实验结果显示MeSTP7具有转运葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖的能力,并对解偶联剂CCCP表现敏感。表明MeSTP7具有广谱的单糖吸收特性,其转运作用依赖于H+-ATP所建立的跨膜质子动力势。综上所述,MeSTP7启动子中含有多个与胁迫相关的顺式作用元件,MeSTP7为定位于细胞膜,具有多种单糖吸收能力的转运蛋白,可以推测MeSTP7参与了木薯可溶性糖的积累活动;MeSTP7的表达受干旱胁迫上调,可能参与了木薯的干旱胁迫反应。