论文部分内容阅读
CHIR99021(简称CHIR)能有效激活J1和F9细胞Wnt/β-catenin信号通路,并能促进多能性基因Nanog表达。miR-211是Wnt/β-catenin信号通路应答的miRNA,CHIR通过激活Wnt/β-catenin诱导miR-211表达。mi R-211在调节细胞多能性方面的报道还比较少,所以本项目主要研究miR-211对F9细胞中多能性因子的调节作用。首先根据文献,用10μmol的CHIR处理小鼠F9细胞,发现细胞中miR-211表达水平显著上调。接下来在F9细胞中分别转染miR-211 mimic及其NC,miR-211 inhibitor及其NC,qPCR及western检测几个多能性因子的表达变化。结果显示,转染mimic后,Nanog、Klf4及Oct4在mRNA水平变化均不显著,而在蛋白水平表达量都呈上升趋势;转染inhibitor后,它们在mRNA水平变化也不显著,但在蛋白水平表达量都呈下降趋势。免疫荧光显示,转染mimic后,与对照组相比,Nanog、Klf4及Oct4的荧光亮度都增强。预示着miR-211对F9细胞多能性的维持具有一定作用。为进一步探究miR-211如何发挥功能,首先从它的靶基因入手。通过软件预测miR-211的靶基因并取交集,聚类分析后,选出在与细胞多能性相关通路上的靶基因进行验证。在F9细胞中转染miR-211 mimic,qPCR初步检测所选的四个靶基因,结果显示Meis1的mRNA水平下调最显著。为验证Meis1是否为miR-211靶基因,首先根据预测的miR-211与Meis1结合位点,构建Meis1野生型及突变型报告载体。双荧光素酶报告分析显示,Meis1会受到miR-211的抑制,而突变掉两者结合位点后,其抑制作用会解除,说明两者的结合位点是突变位点。qPCR及western blot结果显示,转染mimic后,Meis1的表达量在mRNA及蛋白水平都显著下调。而转染inhibitor后,Meis1的表达量在m RNA及蛋白水平都有上调趋势。由此可以确定Meis1为mi R-211的靶基因。对靶基因Meis1功能的研究,首先构建了Meis1的表达载体。用CHIR处理F9细胞,当浓度为10μmol时Meis1在mRNA水平显著下调,显示CHIR可能是通过促进miR-211表达从而抑制Meis1表达。接下来用qPCR及western的方法检测Meis1对F9细胞中多能性因子的调节作用。结果显示,过表达Meis1后,Nanog在mRNA及蛋白水平都呈下调趋势,Klf4和Oct4在m RNA水平下调趋势不显著,两者在蛋白水平都显著下调。干扰Meis1后,Nanog和Oct4在mRNA和蛋白水平都呈上调趋势。Klf4在m RNA水平上调趋势不显著,在蛋白水平显著上调。由此显示miR-211对F9细胞中Nanog、Klf4及Oct4的调节作用可能是通过靶向Meis1来完成的。本项目主要探究了CHIR处理F9细胞后,促进细胞中miR-211的表达,miR-211通过靶向Meis1来调节细胞中Nanog、Klf4及Oct4的表达。由此说明miR-211对F9细胞多能性的维持具有一定的作用。