背景： Bmi-1(B-cell—specificmoloneyleukemiavirusinsertsite1，B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1)基因，属于多梳基因(Polycombgroup，PcG)家族成员，1991年在鼠淋巴瘤中被发现。人Bmi-1基因定位于10号染色体短臂13区(该区域被认为与各种白血病染色体易位有关)，其DNA大小为4.9kb，mRNA为3199bp，含10个外显子，编码含326个氨基酸的蛋白质，分子量为36.9KD。BMI-1蛋白的氨基端为指环结构域，具有转录调节作用；中间部分为螺旋-转角-螺旋-转角(helixturnhelixturn，H—T—H—T)结构，是DNA结合域，并与转录抑制有关：羧基端为PEST序列，与Bmi-1在细胞内快速降解有关。 癌基因Bmi-1与肿瘤的发生关系密切，在多种肿瘤中均呈现高表达，如非小细胞性肺癌、结肠癌、鼻咽癌等。Bmi-1参与细胞周期、干细胞增殖、分化与衰老的调控，也可以诱导细胞的早期转化。 在哺乳动物细胞中，中心体由一对中心粒及其包绕在周围的大量其它功能蛋白质组成，每一次细胞分裂都伴随着一次中心体的复制和分裂。中心体在细胞的有丝分裂中对细胞两极纺锤体的形成起重要作用。在细胞分裂过程中，中心粒的正常复制对于细胞染色体的正确分裂起关键作用，其活动与细胞分裂、激活及复制密切相关。中心体的复制周期与细胞的分裂周期有密切联系而且与其相吻合，假如中心体的复制周期不能紧密与细胞分裂周期相吻合，则产生两个以上的中心体，出现中心体扩增，这种现象常发生在体外培养的肿瘤细胞及不同分期的肿瘤组织中。 我们的前期研究证实Bmi-1可在乳腺癌细胞系中引起中心体扩增，但是其诱导中心体扩增的可能机制目前尚不清楚。本课题将进一步探讨Bmi-1对鼻咽癌细胞中心体复制调控的作用，并对其可能的机制进行初步研究。 研究目的： 研究Bmi—l对鼻咽癌细胞株中心体复制的调控作用，并探讨其可能的分子机制。 实验方法： 1.细胞培养 本实验所用的鼻咽癌细胞6—10B及CNE2均用含10％的FBS的1640培养。 2.载体 分别构建高表达Bmi-1载体pMSCV/Bmi-1及含有Bmi-1-RNAi的pSuper-retro—BMI-RNAi(s)。 3.WesternBlot细胞裂解液裂解细胞，BCA试剂盒进行蛋白定量，聚丙烯酰胺分离，并将蛋白电转至PVDF膜上，抗体孵育，胶片显影。 4.逆转录PCR用Trizol提取细胞的总RNA，定量之后取2ug做逆转录PCR。 5.免疫荧光染色对异常复制的中心体进行计数，并对相关的分子进行定位及定量。 6.统计学分析采用SPSS13.0进行数据分析，P<0.01(双侧检验)认为有统计学意义。 实验结果： 1.成功建立了稳定高表达Bmi-1的细胞株6-10B/Bmi-1及Bmi-1-RNAi稳定起作用的细胞株CNE2/Bmi-1-RNAi用逆转录病毒感染的方法成功建立稳定外源性高表达Bmi-1的鼻咽癌上皮细胞株6-10B/Bmi-1；用同样的方法成功建立了Bmi-1-RNAi稳定起作用的鼻咽癌细胞株CNE2/Bmi-1-RNAi。嘌呤霉素筛选3天后，连续传代，检测第7代细胞中mRNA和蛋白水平Bmi-1的表达量，结果证实稳定细胞株的成功建立。 2.Bmi-1能诱导中心体的扩增在稳定高表达外源性Bmi-1以及Bmi-1-RNAi稳定起作用的的鼻咽癌细胞中采用免疫荧光染色的方法，计数各组细胞中出现中心体异常复制的个数，并进行统计学分析，与空质粒相比较，发现外源性高表达Bmi-1的细胞中心体出现更多的异常复制，而Bmi-1-RNAi的细胞中心体异常复制的个数减少，两组均有统计学差异。 3.Bmi-1通过激活AKT通路引起中心体扩增用免疫荧光染色及westernblot等方法对AKT信号通路及cyclinD1-P27分子进行定位及定量，发现Bmi-1能激活AKT及GSK，并能使β-catenin发生定位改变，从胞膜上转位至胞核，上调cyclinD1的表达，下调P27的表达。 用AKT信号转导通路阻滞剂阻断这条通路之后，Bmi-1诱导的中心体扩增现象得到了逆转，推断Bmi-1诱导中心体的扩增是通过激活AKT信号转导途径实现的。 结论： 1.Bmi-1可以诱导鼻咽癌细胞中心体的扩增； 2.Bmi-1引起的中心体扩增可能是通过激活AKT信号转导途径，进而上调cyclinD1、下调P27实现的。