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黏膜免疫系统作为人体抵抗外来病原体的第一道防线,发挥重要的抗病毒作用。通过在肠黏膜表面诱生特异性的黏膜免疫应答可以有效抵抗病毒和细菌等的攻击,从而控制感染程度。因此黏膜疫苗的开发受到了研究者的亲睐,但是由于黏膜疫苗诱生免疫应答能力的不足和诱导免疫耐受的倾向,目前只有少量的黏膜疫苗研制成功并投入使用。因此在黏膜疫苗的的研制过程中如何提高其免疫应答能力成为一个急需解决的问题。M细胞是位于派氏结中的一种特化的上皮细胞,数量较少。其基底部是不连续的,能够允许淋巴细胞的自由通过,有利于其抗原转运速率的提高。与其邻近肠上皮细胞相比,M细胞顶膜面缺乏较厚的糖萼结构和粘液,这使得M细胞顶膜的关键受体易于被细菌或病毒识别并结合,促进其对外来病原体的识别。因此,我们利用M细胞这种特殊的结构设计了一种新型的M细胞靶向性疫苗。GP2是一类糖蛋白,作为抗原识别受体特异性的表达于小肠上皮M细胞顶膜面,是第一个被发现在人和小鼠M细胞表面均能表达的分子,具有更好的特异性。已发现大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白FimH能够与GP2特异性结合。因此,我们在实验室原有疫苗CS-pVPl的基础上引入FimH蛋白,设计一种新型的黏膜递送系统,从而评估其的诱生CVB3特异性的黏膜免疫应答及其对CVB3诱导的病毒性心肌炎的保护作用。目前我们已有的结果：一、CS-FimH-DNA递送系统的构建及其特性研究M细胞靶向递送系统CS-FimH-pVP1的制备及其理化性质的研究：通过EDC活化FimH蛋白的羧基,使其能够与CS的氨基相互作用进而使两者偶联到一起,制备成CS-FimH靶向递送系统。采用复合物共沉淀法将已制备好的FimH-CS递送系统与pcDNA3.1-vp1质粒混合制成实验所需的纳米粒。结果显示：(1) 我们的偶联效率大约为60%,即接近60%的FimH蛋白与CS发生偶联反应。(2) 在CS-FimH靶向系统的保护下,DNA可以避免被DNaseI酶解,很好的保护了DNA使其能够顺利到达靶向部位。通过粒径检测发现该纳米粒的粒径大约在200-400nm之间。二、口服免疫诱生的CVB3特异性免疫应答及免疫保护靶向性疫苗CS-FimH-pVP1口服免疫小鼠后诱导的CVB3特异性黏膜免疫应答：我们的实验组为CS-FimH-pVP1,对照组为CS-pVP1,空载对照组CS-FimH-pcDNA3.0 和 CS-pcDNA3.0。隔周免疫BALB/c小鼠,共免疫四次,每次免疫的质粒总量为25ug。末次免疫后两周CVB3攻毒,检测该疫苗诱生的CVB3特异性的黏膜免疫应答。结果显示：(1) 靶向性疫苗CS-FimH-pVP1经口服后可以诱导高水平的黏膜IgA抗体,但是没有显著诱生高水平的血清IgG水平。(2) 靶向性疫苗CS-FimH-pVP1经口服后可以促进IgA抗体亲和力成熟,但是IgG的抗体亲和成熟没有显著差异。(3) CVB3特异性的T细胞杀伤活性(CTL)检测发现与对照组CS-pVP1免疫的小鼠发现,经实验组CS-FimH-pVP1免疫的小鼠的MLN部位能有诱生较强的CTL,具有统计学意义。(4) CVB3特异性淋巴细胞增殖实验显示发现与对照组CS-pVP1免疫的小鼠发现,经实验组CS-FimH-pVP1免疫的小鼠在MLN部位诱生了有效的淋巴细胞增殖反应。(5)IFN-γ+ ELISPOT实验检测小鼠脾脏和MLN部位T细胞分泌IFN-γ+能力,发现经实验组CS-FimH-pVP1免疫的小鼠MLN部位T细胞分泌IFN-γ+的能力显著高于对照组CS-pVP1,但是在脾脏部位T细胞分泌IFN-γ+的能力与对照组相比并没有显著增强。评估靶向性疫苗CS-FimH-pVP1对感染CVB3的小鼠的免疫保护作用。结果显示：(1) 末次免疫两周后的小鼠经CVB3腹腔感染后开始称量小鼠体重,观察感染病毒小鼠体重变化情况,我们发现经靶向性疫苗CS-FimH-pVP1免疫过的小鼠感染CVB3后体重变化较少,体毛顺滑,饮食正常。而对照组CS-pVP1小鼠的体重下降较为明显,且小鼠状态较差,活动减少。(2) CK、CK-MB可以作为诊断心肌炎的一个重要指标。CK、CK-MB的检测结果显示CS-FimH-pVP1免疫组的CK及CK-MB的指标明显低于CS-pVP1免疫组,具有统计学意义(P<0.05)。说明经CS-FimH-pVP1免疫过后的小鼠的心肌炎的症状较轻。(3) 由CVB3感染而引起的急性心肌炎以心肌细胞的坏死和炎性细胞的浸润为特征。心肌病理切片结果显示空载组小鼠的心肌细胞损坏严重并夹带炎症,炎性淋巴细胞成团分布；而CS-pVPl组小鼠的心肌坏死有所减轻,只有少量的炎性淋巴细胞聚集在一起成团分布和坏死灶的数量也有所减少；CS-FimH-pVP1组小鼠的心肌细胞损坏最少,炎性细胞成团现象也明显减少,无明显异常,正常心肌细胞病理切片状态相似。(4)CS-FimH-pVP1免疫组小鼠感染病毒后心脏病毒滴度的测定结果显示：FimH-CS-pVP1免疫组小鼠心肌细胞的TCID5o明显低于对照组CS-pVPl。说明FimH-CS-pVP1免疫组诱生的黏膜免疫应答能够有效清楚小鼠感染的CVB3病毒。(5) 为进一步评价各组疫苗诱生的免疫保护效应,取末次免疫后两周的小鼠进行致死剂量攻毒结果发现空载组在第七天左右全部死亡,对照组CS-pVPl 大约有40%的生存率,而CS-FimH-pVP1免疫组则有大约接近70%的生存率。(6) 小动物超声成像系统可以监测小鼠心脏的收缩和舒张指标,从而评价小鼠的心功能水平FimH-CS-pVP1免疫组小鼠左心室收缩压以及射血分数的数值趋于正常组小鼠,相比于对照组CS-pVPl有显著提高,说明FimH-CS-pVP1可以明显改善感染CVB3病毒小鼠的心功能。三、CS-FimH-pVP1增强黏膜免疫应答的机制靶向性疫苗CS-FimH-pVP1口服免疫诱生的CVB3特异性的黏膜免疫应答的机制化探讨(1) 体外成功构建M细胞模型。UEA-1的表达证明我们的M-c ell体外模型构建成功。(2) M细胞对CS-FimH-pVP1纳米粒的转运效率的检测显示M细胞对CS-FimH-pVP1纳米粒的转运效率随着时间的增加而逐渐提高,并且显著高于对照组CS-pVP1。(3) 免疫荧光的方法分析该纳米粒的CS-FimH-pVP1是否是通过GP2的介导而被M-cell所摄取,我们可以发现,具有靶向性能力的CS-FimH-pVP1纳米粒与GP2具有较多的共定位,而对照组CS-pVP1则几乎没有与GP2的共定位。综上所述,我们成功制备了M细胞靶向性疫苗C S-FimH-pVP1,并且该疫苗成功诱导了CVB3特异性的黏膜免疫应答和免疫保护作用。这将给CVB3诱导的病毒性心肌炎提供一个新的免疫战略思想。