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背景作为世界上最常见的恶性肿瘤之一,肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)容易复发或转移,对放疗或者化疗均不敏感,并且靶向治疗的有效性以及有效持续时间也无法获得满意的效果。因此,开发新的有效治疗途径对于探讨肾细胞癌发生、发展的分子机制至关重要。近年来,自噬(Autophagy)对于肿瘤的抑制作用越发受到关注。在肿瘤早期,自噬通过降解细胞内的合成物质,抑制肿瘤增殖[1]。研究发现,在肾细胞癌细胞系及肿瘤组织中,自噬呈受抑制状态,且自噬水平与肿瘤分期、分级负相关,提示自噬可能发挥诱导肿瘤死亡的作用[2]。有趣的是,最近发现趋化因子能够通过负向调控自噬而影响乳腺癌细胞的生长和存活[3]。我们的前期研究发现,CX3CR1(Fractalkine的受体)[4]、血小板源性生长因子(PDGF-B)[5]通过对肿瘤增殖、迁移、血管新生的过程进行调控,从而影响RCC的生长和进展,趋化因子及其受体的表达水平在患者的预后方面有潜在的价值。因此,我们设计了该课题以进一步明确CXCL5(Chemokine CXC motifligand 5)在肾癌组织及细胞中的发生发展中的作用,并揭示CXCL5能否通过调控肿瘤的自噬作用进而影响RCC的进展。方法1.使用肾癌患者组织石蜡标本进行CXCL5免疫组织化学染色,根据CXCL5表达情况,将患者分成低、中、高表达组,收集临床病理学资料,判断各组的表达情况与其临床病理资料之间的相关性,并且通过深入检索CbioPortal数据库,分析CXCL5的表达与患者预后之间的关系。2.qRT-PCR验证在3个肾癌细胞系中的CXCL5的表达情况,应用慢病毒感染构建过表达稳定的CXCL5细胞系以及敲除CXCL5的稳定降表达细胞系,我们评价敲除CXCL5的降表达稳定对于细胞形态、增殖、促血管新生能力的影响。3.我们通过使用构建裸鼠皮下移植瘤模型,验证shRNA-CXCL5组肿瘤细胞的生长情况,在体内实验进行验证敲除CXCL5的稳定降表达细胞系对于肾癌细胞生长的影响。4.利用Western Blot检测肿瘤细胞中EMT相关蛋白的表达情况,用与GFP融合表达的LC3的质粒与shR-CXCL5的质粒或对照质粒共同转染肾癌细胞,检测CXCL5对于PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。结果1.CXCL5在肾癌肿瘤组织中表达的表达情况具有重要的临床意义。本课题通过对62例肾细胞癌组织标本进行免疫组化染色分析,根据CXCL5表达情况,将患者分成低、中、高表达组,收集患者临床病理学资料,判断各组的表达情况与其临床病理资料之间的相关性,我们发现CXCL5在组织中的表达水平与肿瘤Fuhrman分期、T分期呈正相关(P<0.05)。通过深入查阅检索CbioPortal数据库,发现来自TCGA的证据显示,CXCL5高表达RCC患者的总生存期(overall survival,OS)与无病生存期(disease free survival,DFS)明显短于CXCL5低表达的RCC患者群体,两者差异明显(P<0.05)。提示CXCL5CXCL5与RCC患者的预后有关。2.CXCL5对于RCC细胞生物学行为的影响。2.1 CXCL5在肾癌细胞中的表达情况我们利用qRT-PCR在3个肾癌细胞系(786-O、A498以及Caki-1细胞系)中的验证CXCL5的表达情况,我们将人类肾小管上皮细胞(HK-2细胞)作为阴性对照。结果显示在肾癌细胞系中CXCL5的表达水平较高。2.2 CXCL5降表达对于体外细胞的影响为了明确CXCL5在肿瘤细胞中的作用,我们应用慢病毒感染构建过表达稳定的CXCL5细胞系以及敲除CXCL5的稳定降表达细胞系。实验结果表明使用shRNA敲降CXCL5的A498细胞外观上表现老化、坏死,细胞增殖能力明显下降,并且经shRNA-CXCL5干扰的肿瘤细胞其促进内皮细胞成管的能力明显下降。利用细胞凋亡实验证实shR-CXCL5能够增加肿瘤细胞早期凋亡。2.3 CXCL5对于体内RCC生长的影响我们构建裸鼠皮下移植瘤模型,结果显示shRNA-CXCL5组肿瘤细胞的生长发育受到明显的抑制,将肿瘤组织进行免疫组化结果验证shRNA-CXCL5组肿瘤细胞血管生成、细胞分裂都受到明显的抑制。2.4 CXCL5对于肾细胞癌EMT的影响我们利用Western Blot对EMT相关蛋白进行检测,结果发现shR-CXCL5组中,E-cadherin的表达水平升高,Vimentin的表达水平降低。而过表达CXCL5的结果相反。3.CXCL5调控肾细胞癌自噬的作用和机制我们利用与GFP融合表达的LC3质粒、shR-CXCL5的质粒以及对照质粒共同转染A498细胞,荧光显微镜下观察CXCL5对于肿瘤细胞自噬的影响。结果显示,敲降CXCL5的细胞自噬能力增强。我们使用Western blot检测CXCL5对于PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响,表明敲降CXCL5可以抑制PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平。结论本课题初步证实了在肾癌中CXCL5的表达水平与Fuhrman分期、T分期呈正相关,在CXCL5高水平表达组的患者中,肿瘤复发比例明显较高,总生存期和无病生存期明显较短;在RCC细胞系中CXCL5表达上调,且敲除CXCL5可以影响肿瘤细胞体内和体外多种生物学行为,其中包括抑制肿瘤细胞的增殖和迁移、促进凋亡以及抑制新生血管的产生等作用;表达CXCL5的RCC细胞系中自噬作用受到明显抑制,而敲除CXCL5可以解除自噬的受抑状态;CXCL5调控自噬的机制可能与PI3K/AKT通路有关。