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目的：CD40 ligand(CD40L，CD154)是Ⅱ型膜糖蛋白，分子量约39KDa，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族。CD40L短暂表达于活化的CD4+T细胞表面。它的天然受体是CD40，主要选择性地表达于上皮肿瘤细胞、间叶肿瘤细胞、造血前体细胞、所有的抗原递呈细胞(APC)、活化的单核细胞和B淋巴细胞等，而绝大多数正常非增殖的上皮组织内少有表达。CD40L和CD40之间相互作用在免疫系统应答过程中起着重要作用。对于免疫细胞，CD40-CD40L结合可以活化抗原递呈细胞，上调共刺激分子表达，调节T细胞激活和T细胞介导的效应功能并参与慢性炎症疾病的病理过程，如自身免疫性糖尿病，移植排斥反应，血管硬化和肿瘤，促进B细胞成熟和免疫球蛋白类别转换；对于肿瘤细胞，CD40L信号可以抑制恶性B淋巴细胞、乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞癌生长，其机制可能是通过细胞周期阻断和/或诱导凋亡产生，同时不会对正常细胞产生损伤。目前已有CD40L相关的试验性治疗用于人白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。CD40L的抗肿瘤效应在于一方面可以通过活化APC增强体内肿瘤免疫排斥应答，一方面通过上调上皮细胞表达共刺激分子和细胞因子增强肿瘤的免疫源性，这些增强免疫效应可以进一步产生“旁观者效应”，使CD40阴性的肿瘤细胞亚群被活化的抗肿瘤活性细胞毒性T细胞消灭。原发性肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤，除手术切除外对放疗和化疗多不敏感，因此免疫治疗和基因治疗成为肝癌治疗领域中的一个令人瞩目的研究重点。由于CD40L具有调节免疫和抗肿瘤的双重效应，我们期望通过构建转染CD40L的肝癌细胞，并对CD40L对肝癌细胞作用效果和机理进行探讨，为肝癌免疫治疗和基因治疗提供理论基础。
方法：人CD40L基因真核表达质粒的构建：从植物血凝素(PHA)活化的人外周血单个核细胞中提取总RNA，通过RT—PCR扩增人CD40L cDNA并插入BamHⅠ和EcoR Ⅰ酶切位点。分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切CD40L cDNA和pcDNATM3.1/myc-His(-)A后连接两者，转入大肠杆菌E.coli DH5α筛选并扩增重组质粒。经过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切以及Hind Ⅲ酶切初步鉴定后，进行序列测定并于PubMed基因数据库进行序列对比。人CD40 ligand基因修饰对人肝癌细胞HepG2的促凋亡作用：将成功构建人CD40L cDNA真核表达载体稳定转染入人肝癌HepG2细胞中。转染分4组，A组HepG2细胞转染重组质粒，B组HepG2细胞转染不含CD40L cDNA的空质粒，C组和D组HepG2细胞正常培养。48 h后A，B，D组细胞加入G418加压筛选，C组细胞继续单纯培养。RT-PCR及流式细胞术鉴定A，B，C 3组细胞表面CD40L和CD40的表达。A，B，C 3组细胞分别设6个复孔培养72h后，流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布和Fas表达。
结果：测序结果显示人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A构建成功。流式细胞术检测A组HepG2细胞表面CD40L表达为39.7％，CD40表达为15.4％；B和C组细胞表面仅有CD40表达，分别为31.7％和28.5％A组细胞凋亡率45.0±0.3％，B，C组均未发生明显凋亡(P＜0.01)。与C组细胞比较，A组细胞周期分布主要阻滞在G0/G1期(90.4±1.3％vs 60.6±1.5％，P＜0.01)，S期(6.32±1.0％vs12.0±0.7％)和G2/M期分布(3.3±0.7％vs27.3±1.2％)均有减少(P＜0.01)。A组细胞Fas表达率(27.8±1.50%)较B组(3.2+0.80±)和C 组(4.2±1.0％)明显上调(P＜0.01)。
结论：实验表明我们构建的人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A序列正确，没有发生点突变，并可以在人肝癌细胞HepG2中稳定表达。稳定表达CD40L的HepG2细胞CD40表达减少，细胞周期阻滞在G0/G1期，Fas表达上调，由Fas/FasL凋亡通路最终导致HepG2发生凋亡。我们的研究揭示CD40L对于HepG2细胞具有直接生长抑制作用，这可能与CD40L—CD40作用后导致HepG2细胞Fas表达上调引发的凋亡和细胞周期阻滞有关。CD40L在肝癌的免疫治疗中抗肿瘤效果值得进一步体内实验研究。