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肝小静脉闭塞病(HVOD)是特殊药物性肝损的严重类型。因其发病机制未完全明了,目前治疗方法有限、效果欠佳,本研究将在建立动物疾病模型的基础上,探讨多效应因子G-CSF对HVOD的可能治疗作用及其机制。第一部分大鼠HVOD模型的建立和评价目的:建立、评价、必要时修改Deleve等提出的野百合碱(MCT)诱导的大鼠HVOD模型以便进一步研究。方法:将42只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为5组(A为正常对照组,B、C为MCT 160mg/kg组,D、E为MCT100mg/kg组),实验第0天采用一次性灌胃法给予MCT或磷酸盐缓冲液PBS,A、B和D组于造模第7天处理大鼠(C、E组在第10天),测定并比较各组大鼠的腹水量、肝/体重、白细胞计数WBC、中性粒细胞百分比Neu%、血小板计数、总胆红素TBil、转氨酶ALT及AST等指标,评估该模型和人类HVOD的相似性;对肝组织行HE、Masson染色后,分别采用Deleve等的光镜评分系统和修改后的评分系统(添加肝窦纤维化和肝细胞凝固性坏死两项,取消早、晚期HVOD的区分)对病理切片进行评分来判断病变的严重程度;并对肝组织行PCNA免疫组化染色。结果:1.组B-D大鼠都有腹水、肝/体重和TBil升高等表现,其中B、C组各有1只在实验第6天死亡,尸检均为重度HVOD;和组A相比,组B出现了WBC、Neu%、ALT、AST的升高及血小板的降低(P＜0.05);和B组相比,C组的腹水量、TBil、Neu%、ALT和AST均有一定下降,但仍高于组A(P＜0.05);E组和D组相比,肝/体重、TBil、腹水、Neu%、ALT和AST均有下降(P＜0.05),其中TBil、腹水、Neu%已和A组无统计学差别(P＞0.05)。2.修改后的病理评分提示B组均属重度;C组中8只属重度,1只为中度;而D组5只属中度,2只为轻度;E组2只属中度,余为轻度。2.组A大鼠的肝细胞也有一定的PCNA阳性率(18.9±6.1%),MCT作用后其值有增加(P＜0.05);而内皮细胞的PCNA阳性率在组A中很低(2.0±0.8%),MCT作用后有所增加,但无统计学意义(P＞0.05)。小结1.MCT能剂量依赖性地诱导大鼠产生HVOD,该模型能较好体现人类HVOD的临床和组织学特征;MCT剂量小时模型的自愈倾向较明显,剂量大时能构造较稳定的重度HVOD;2.该HVOD模型的肝组织中存在肝窦纤维化和肝细胞凝固性坏死,故修改后的光镜评分系统能更好反映组织学的变化;3.该模型的自愈倾向可能和受损后肝内PCNA阳性细胞百分比的升高有关。第二部分G-CSF对HWOD的治疗作用及其机制探讨第一章G-CSF对MCT诱导的大鼠IWOD的治疗作用目的:探讨不同剂量的G-CSF对大鼠HVOD的可能治疗作用和疗效。方法:将36只雄性SD大鼠随机分为4组(A为正常对照组,B-D为MCT 160mg/kg,采用一次灌胃法造模),灌胃后第3天始予以皮下注射G-CSF 10μg/kg(治疗组C)、100μg/kg(治疗组D)或等量生理盐水NS(模型组B),每天1次,共7天,于实验第10天处理大鼠,测定各组大鼠的腹水量、肝/体重、WBC、Neu%、血小板计数、TBil、ALT和AST等指标;采用修改后的方法对组织切片进行病理学评分,了解病变严重程度;免疫组化染色后计算肝组织PCNA阳性细胞百分比,用ELISA法测定血浆中肿瘤坏死因子TNF-α、凝血酶原激活物抑制因子PAI-1的含量。结果:1.和对照组A相比,治疗组C、D仍表现为肝/体重、TBil增加和腹水,但和模型组B相比,其值均有下降(P＜0.05);在实验室指标上,D组WBC、Neu%有所升高,C组变化不明显,而C、D组转氨酶均下降至接近正常水平,且两组间无统计学差别(P＞0.05);在细胞因子的检测中发现,组A中TNF-α和PAI-1的含量均较低,在组B中其值明显升高,经G-CSF处理后下降(P＜0.05),但在治疗组C和D之间无统计学差异。2.和模型组B相比,治疗组的光镜下评分有明显下降(P＜0.05),但C、D组之间无统计学差别。3.模型组B肝组织中PCNA阳性细胞百分比较对照组A有所升高(尤其是肝细胞,P＜0.05),而G-CSF治疗后HVOD大鼠肝细胞和SEC的PCNA阳性百分比明显升高,但C、D组之间无统计学差别。小结:1.常规剂量和小剂量的G-CSF对HVOD均有一定的治疗作用,能减轻患鼠的临床症状、改善其实验室指标,从而延缓病情的进展,但应用常规剂量时应注意其伴随的血白细胞(中性粒细胞)增加;2.血PAI-1可作为该模型中病情和疗效的监测指标;3.G-CSF处理可使肝PCNA阳性细胞百分比升高、血TNF-α值降低,其作用机制可能和G-CSF具有促进细胞再生、抑制TNF-α的分泌有关。第二章G-CSF对INOD大鼠肝组织G-CSFR、STAT3等表达的影响目的:通过检测和比较各组大鼠肝组织中G-CSFR、STAT3等基因在转录和蛋白水平的表达来探讨G-CSF缓解HVOD的可能分子机制。方法;将各组大鼠(组A—PBS+NS、B组—MCT 160mg/kg+NS、C组—MCT160mg/kg+G-CSF10μg/kg、D组—MCT160 mg/kg+G-CSF 100μg/kg)的肝组织,包括4%甲醛固定的和在-80℃冰箱内冻存的,用免疫组化、RT-PCR和Western blot等方法检测G-CSFR、STAT3和p-STAT3的表达,并用ANOVA等统计方法进行各组间的比较。结果:各组大鼠的肝组织中均有G-CSFR、STAT3和p-STAT3表达;从相对表达量上看,模型组B稍有增加,但和对照组A无统计学差别(P＞0.05),而G-CSF治疗组的表达有显著增加(P＜0.01),但C、D组之间的差别无统计学意义(P＞0.05)。小结:G-CSFR、STAT3和p-STAT3在HVOD大鼠肝组织中的存在及G-CSF治疗后其表达量的增加提示G-CSF可能通过G-CSFR介导的JAK-STAT3途径对HVOD大鼠的肝组织起到保护作用。