目的克隆分离异质性喉癌细胞亚群,筛选喉癌干细胞候选表面标志物;分离、鉴定喉癌干细胞并针对其生物学特性进行深入研究;探讨干细胞自我更新通路关键调控因子Bmi-1在喉癌干细胞中的表达情况及与喉癌临床病理学特性的相关性,评价其在喉癌发生、发展中的作用;构建H1/U6双启动子siRNA Bmi-1重组表达载体。方法比较异质性细胞亚群在功能状态、细胞表面抗原及裸鼠异体移植成瘤能力等方面的差异,筛选喉癌干细胞的候选表面标志物。亲和板结合分离法分选CD44+和CD44-喉癌细胞,比较两亚群细胞肿瘤干细胞生物学特性的差异。流式细胞仪分选CD44+、CD133+、CD44+CD133+、CD44+CD133-细胞,通过检测动物体内致瘤能力、体外增殖能力、侵袭能力、软琼脂克隆形成率、无血清培养基中生长及分化情况、SCA-1、整合素-β1和Bmi-1因子的表达情况来鉴定喉癌干细胞。采用RT-PCR方法及SP免疫组织化学法检测Bmi-1在喉癌中的特异性表达情况,分析其与临床病理特征的相关性。根据人Bmi-1基因mRNA序列,靶向其功能位点合成4对编码siRNA的DNA模板,与线性化的双启动子PFIV-H1/U6 siRNA表达载体相连接,筛选阳性克隆并酶切鉴定。结果I型喉癌细胞具备肿瘤干细胞特性。CD44和CD133抗原可以作为喉癌干细胞的候选标志物。CD44+CD133+喉癌细胞具有低密度下的高致瘤能力,高侵袭能力,体外高增殖能力、在无血清培养基中呈肿瘤球状生长并在添加血清后具备分化能力,高表达整合素-β1、SCA-1及Bmi-1因子。Bmi-1在喉癌组织中呈特异性高表达,并与喉癌的病理学特征密切相关。经酶切鉴定成功构建了H1/U6双启动子siRNA Bmi-1重组表达载体。结论喉癌组织由异质性细胞群体组成;CD44+CD133+喉癌细胞亚群可以被初步鉴定为喉癌干细胞且高表达Bmi-1因子,Bmi-1可以作为喉癌治疗的新靶点;成功构建H1/U6双启动子si-Bmi-1重组表达载体为下一步通过体内外实验筛选Bmi-1有效抑制靶点奠定了前期工作基础。