论文部分内容阅读
流行性乙型脑炎(JE)是由流行性乙型脑炎病毒(JEV)感染引起的一种严重人畜共患传染病。对人类的健康和畜牧养殖业的危害非常大。近年来由于全球气温变暖,乙脑的流行区域不断扩大,虽然乙脑疫苗的推广使用降低了乙脑的发病率,但是流行的频率却在增加,而且流行的基因型也在逐渐的演变。由于乙脑的治疗没有特效药,因此对乙脑的防治必须加强流行病学监测,以便针对性地采取防控措施。猪是JEV最重要的贮藏和扩散宿主,而且我国养猪业十分庞大,人猪接触频繁、密切。蚊是JEV的主要传播媒介,由于蚊感染JEV后可带毒越冬经卵传代,所以蚊也是病毒的贮存宿主。因此对地区范围内猪和蚊所携带的流行性乙型脑炎病毒进行分子流行病学监测,可以评估该地区乙脑的流行状况。在云南省采集蚊样品,首先将疑似的蚊悬液样品接种BHK-21单层细胞,待出现细胞病变后接种于乳鼠脑内,反复传代至病毒适应鼠脑。提取RNA鉴定为阳性病毒RNA为模板利用PCR扩增E基因片段,克隆到pMD18-T载体后由上海生工测序。通过对测序结果的比对分析,确定分离到1株乙型脑炎病毒,命名为云南1101株,对新分离到的YN/11/01毒株进行E基因序列和基因系统进化分析,表明得到的新毒株与SA14-14-2碱基序列同源性为99.7%。本实验利用从云南蚊样品中分离的YN/11/01株设计了针对JEV E基因RT-PCR的鉴定引物JEV E1/JEV E2和Real-time PCR引物JEV YG1/JEV YG2。对YN/11/01株进行RNA提取,并用RT-PCR方法扩增得到JEV E基因片段,通过基因的克隆和转化构建了标准质粒pMD18-T-JEV-E。并以该标准质粒pMD18-T-JEV-E为模板,建立了基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR检测方法,选取Ct值制作标准曲线。本研究建立的标准曲线呈现良好的重复性,0.99<r2<1,熔解曲线为单一峰型,未出现非特异性扩增。与传统RT-PCR方法相比SYBR Green I实时PCR的灵敏度要高10倍,而且与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、辛德毕斯病毒,均不发生非特异性扩增,具有良好的特异性。以该检测方法为基础,对云南地区采集的374份蚊子和212份猪脑样品进行检测,检测结果表明库蚊与按蚊携带JEV阳性率分别为33.1%、30.3%,采集猪脑与送检猪脑的JEV阳性率分别为17.2%、24.3%。并与传统RT-PCR检测方法进行比较,检出的阳性率均高于传统方法,且检测时间缩短一半。其中有差异的样品通过病毒分离方法鉴定,得到结果与SYBR Green I荧光定量PCR检测方法一致。