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心脑血管疾病严重危害人类的健康,《中国心血管病报告2010》中的数据显示,我国每年约有300万人死于心血管疾病,占全部死亡原因的40%左右,居各种死因之首。相关资料显示：这类疾病的发生是非正常的凝血过程所导致,与血管壁、血小管、抗凝、纤溶及血液流变等密切相关。本实验以广东菲牛蛭为研究对象,对其中的抗凝活性蛋白进行了提取纯化,使用了超滤技术和冷冻干燥技术进行浓缩,同时结合DEAE阴离子柱和ODS反相柱进行分离,初步分离出4种蛋白,利用基质辅助激光解析—飞行时问二级质谱(MALDI-TOF-MS/MS)进行测定,并简单建立专属数据库。在提取工艺方面,以抗凝活性回收率为指标,考察不同沉淀方法对菲牛蛭体内抗凝活性成分的影响,从而确定了乙醇沉淀工艺,并采用单因素考察法优选提取工艺。最终优选结果为：在匀浆上清液中滴加冷乙醇至终浓度20%,去除部分杂蛋白,离心后上清液继续滴加冷乙醇至终浓度80%,离心,获得菲牛蛭活性粗提物。经测定,所含抗凝活性单位为在纯化工艺方面,以抗凝活性回收率和蛋白纯度为指标,考察不同层析介质对目的蛋白的吸附性差异,最终确立了阴离子柱层析和ODS反相层析两种方法。经考察,DEAE阴离子层析的最佳分离条件为：0.02mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液,不同浓度的氯化钠溶液作为洗脱缓冲液,紫外254nm在线监测,同时测定抗凝活性；ODS反相层析的最佳分离条件为：20%乙醇-水-三氟乙酸(含0.03%NaH2PO4)作为平衡体系,30%乙醇-水-三氟乙酸(含0.03%NaH2PO4)作为洗脱体系,254nm在线检测,同时测定抗凝活性。结果获得4个蛋白多肽,电泳纯,其中一个为主要抗凝活性多肽,经SDS-聚丙烯凝胶电泳测定分子量为19.2KDa。在含量测定方面,采用凝血酶滴定法测定其生物活性,二喹啉甲酸法测定其蛋白含量,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白及MALDI-TOF-MS/MS进行蛋白鉴定,结果显示：所得蛋白多肽含单位抗凝血酶活性单位不低于2742ATU/mg,对NCBI数据库进行搜索没有发现相似结构的物质。研究结果表明,利用乙醇沉淀、阴离子交换柱层析和反相层析对菲牛蛭抗凝活性物质进行分离纯化,工艺设计合理、稳定可行。