苹果质膜内在水通道蛋白基因MdPIP2;5的克隆和功能分析

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水通道蛋白(Aquaporin,AQPs)作为跨膜通道蛋白,能够运输水和其他小分子,在植物生长发育及抵御逆境胁迫等过程中均发挥重要作用。质膜内在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)定位于细胞质膜,是AQPs的一个亚家族,PIPs根据C末端和N末端的序列特征又分为两个亚组:PIP1和PIP2。本论文以‘秦冠’苹果为材料克隆获得了MdPIP2;5基因的两种亚型,分别命名为MdPIP2;5a和MdPIP2;5b,其中MdPIP2;5b缺少两个跨膜螺旋,不具备典型完整的水通道蛋白结构;此外通过对过表达MdPIP2;5a和MdPIP2;5b的转基因拟南芥和转基因苹果愈伤的抗逆性特征分析,探究MdPIP2;5a和MdPIP2;5b的功能。所得的结果如下:1.qRT-PCR结果表明,MdPIP2;5基因在根茎叶中都有表达,与叶片和茎相比,在根中的表达水平最高。2.MdPIP2;5a的开放阅读框(Open reading frame,ORF)长846 bp,编码282个氨基酸;MdPIP2;5b的ORF长657 bp,编码219个氨基酸,MdPIP2;5b缺少两个重要的跨膜螺旋,不具备典型完整的水通道蛋白结构特征;启动子序列分析表明,MdPIP2;5基因的上游启动子存在多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件;亚细胞定位结果显示MdPIP2;5的两种亚型均定位在细胞质膜上。3.在拟南芥中分别过表达MdPIP2;5a及MdPIP2;5b基因,均增强了转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性。在100 m M和150 m M的氯化钠处理下,MdPIP2;5a和MdPIP2;5b基因过表达拟南芥种子的萌发率,幼苗的根长及鲜重都显著低于野生型。在300 m M的氯化钠处理下,过表达MdPIP2;5a和MdPIP2;5b基因的转基因拟南芥与野生型植株相比叶片相对电导率和丙二醛的含量显著提高,抗氧化物酶活性显著降低,存活率显著降低。4.在拟南芥中分别过表达MdPIP2;5a及MdPIP2;5b基因,均提高了转基因拟南芥对低温胁迫的耐受性。在4℃低温无光照处理条件下,MdPIP2;5a和MdPIP2;5b过表达拟南芥种子的萌发率,幼苗的根长及鲜重都显著高于野生型。在-20℃处理2 h,25℃室温正常光照恢复3 d后,过表达MdPIP2;5a和MdPIP2;5b基因拟南芥成苗叶片相对电导率显著降低,存活率显著提高。5.在‘王林’苹果愈伤中过表达MdPIP2;5a及MdPIP2;5b基因,均增加了愈伤对盐胁迫的敏感性。在60 m M和80 m M的氯化钠处理下,过表达MdPIP2;5a及MdPIP2;5b基因‘王林’愈伤的鲜重均显著低于野生型。
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