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短季棉的早熟早衰问题严重影响棉花的产量和品质;目前短季棉早熟早衰问题,在生理生化水平已经作了比较详细的研究,已有的结果显示:早熟不早衰品种和早熟早衰品种相比,它们的抗氧化酶活性后期表现高、稳定,主要起作用的关键酶是SOD,因此,进一步从分子水平揭示早熟早衰的分子机制,克隆相关基因并进行有关研究是非常必要的,对于提高短季棉产量、品质具有重要的意义。 (1)以短季棉早熟不早衰品种中棉所36真叶为材料,对其进行伤诱导和高温处理,然后提取总RNA,得到cDNA,以处理叶片的cDNA为模板,利用RACE技术,克隆了在棉花SOD酶活中占比例最大的Cu/Zn SOD基因(约占86%),该基因包括两个:叶绿体Cu/Zn SOD基因和胞质Cu/Zn SOD基因。其中叶绿体Cu/Zn SOD基因的注册号为DQ120514,基因序列长度1043bp,包含一个645bp的开放阅读框,起始于98位终止于745位,编码215个氨基酸。在棉花基因中是两个拷贝,棉花叶绿体Cu/Zn SOD蛋白与其它植物的叶绿体Cu/Zn SOD蛋白的氨基酸同源性为65.7%～81%。棉花叶绿体Cu/Zn SOD蛋白质的分子量为25.0KD,等电点为6.11。该蛋白质具有两个酶活性中心,位于叶绿体的基质中,是个球蛋白。胞质Cu/Zn SOD基因的注册号为DQ445093,基因序列长度682bp,包含一个456bp的开放阅读框,起始于120位终止于578位,编码152个氨基酸。在棉花基因中是一个拷贝,棉花胞质Cu/Zn SOD蛋白与其它植物的胞质Cu/ZnSOD蛋白的氨基酸同源性为81%～87%。棉花叶绿体Cu/Zn SOD蛋白质的分子量为15.03KD,等电点为6.09。该蛋白质具有两个酶活性中心,位于细胞质中,是个球蛋白。 (2)基因表达分析表明:叶绿体Cu/Zn SOD基因在幼嫩的茎、花中有微量的表达,在叶片中高效表达;在中棉所36的苗期、始花期、盛花期、铃期和吐絮期分别采真叶提取RNA检测叶绿体Cu/Zn SOD基因的表达结果显示:基因在苗期表达较低,到初花期到达最高,然后表达量下降。 胞质Cu/Zn SOD基因表达活性在根中最高,其次为叶片,下胚轴,花和茎的表达较弱。说明胞质Cu/Zn SOD基因主要在根和叶片中表达;在整个棉花生育期中呈现有规律的动态变化,从苗期开始基因表达逐渐增强,到盛花期达到顶峰,以后逐渐下降;但是从整个生育期观察,后期的活性比前期高。 (3)棉花叶绿体Cu/Zn SOD基因的原核表达检测:在基因的起始密码子和终止子处设计一对引物,以cDNA为模板扩增得到完整的基因全长,然后,构建中间重组子pUC-1-SOD;再构建原核表达载体pET-Cu/Zn-SOD,IPTG诱导表达结果显示转化菌株比对照组SOD酶活增高17%,显示表达产物具有SOD酶的活性。 (4)棉花叶绿体Cu/Zn SOD基因的植物转化载体的构建:在基因的起始密码子和终止子处设计一对引物,以cDNA为模板扩增得到完整的基因全长,构建中间重组子pUC-2-SOD,然后,再构建植物转化载体pBIY-SOD,双酶切及PCR检测均证实载体构建正确。