研究背景及目的：　　 炎症是动脉粥样硬化(AS)发生、发展过程中的一个重要因素，炎症的发生常常关系到动脉粥样硬化的进程、严重程度及其后果。炎性因子的分泌能够引起单核、巨噬细胞的趋化、迁移，进一步加重炎症反应。血管平滑肌细胞位于血管壁的中层，在正常的生理状态下这些细胞通常是“安静”的，表现出一种分化状态来维持血管的结构及其紧张度。然而，在某些条件下（如动脉粥样硬化形成），血管平滑肌细胞获得了一种“分泌”型的表型，表现为去分化状态，并能够合成、分泌一些炎性因子，从而促进了血管的病变过程。　　 精氨酸酶Ⅰ(ArgⅠ)能够促进平滑肌细胞的增殖，但其在炎症反应中的作用还未明确。L-精氨酸是精氨酸酶(Arginase)和一氧化氮合成酶(NOS)的共同催化底物。在炎症反应中，iNOS能够产生过量的一氧化氮(N0)，通过与细胞内的超氧阴离子（02.-）反应产生有致炎作用的ON00-。因此，减少iNOS的底物有助于抑制细胞内的炎症。　　 在以往研究的基础上，我们提出如下假设:1）精氨酸酶Ⅰ具有抑制细胞内炎症作用;2）精氨酸酶Ⅰ抑制炎症的作用是通过与iNOS竞争底物实现的。本研究正是基于以上思路，拟通过体外和体内两部分实验以验证这一假说。　　 旨在探讨ArgⅠ在平滑肌细胞(SMC)炎症反应中的作用，以期寻找到与SMC相关的炎症性疾病的预防和治疗靶点。　　 材料与方法：　　 1.细胞培养及模型建立:　　 采用人主动脉平滑肌细胞(hASMCs)作为研究对象;体外以脂多糖(LPS)作为诱导剂诱导hASMCs发生炎症反应。　　 2.细胞内ArgⅠ干预:　　 采用瞬时转染ARGI-pcDNA3.1(+)质粒和si-ARGI小干扰片段的方式实现对hASMCs细胞内ArgI的干预。　　 3.动物模型的建立及干预:　　 新西兰大白兔采用腹主动脉球囊拉伤+高脂喂养的方式建立动脉粥样硬化斑块模型，于喂养12周后按照本实验室建立的斑块内注射的方法对斑块进行ARGI过表达及小干扰慢病毒载体转染，继续喂养四周后将动物实施安乐死后取材。　　 4.采用酶联免疫吸附法(ELISA):　　 检测平滑肌细胞培养中的肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量;　　 5.实时定量逆转录PCR(Real-timeRT-PCR)、Western-blot及酶活性检测法:分别检测精氨酸酶Ⅰ(ArgⅠ)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的基因表达水平、蛋白质表达水平及酶活性变化。　　 6.单核细胞趋化及迁移检测:　　 采用Transwell小室构建了人单核细胞(THP1)与hASMCs的共培养体系，检测单核细胞的趋化及迁移能力。　　 7.细胞荧光免疫组化及组织荧光免疫组化:　　 显示细胞内的ArgⅠ、iNOS、NF-κB的P65亚基、斑块内细胞成分及TNFα的表达。　　 8.流式细胞术、激光共聚焦显微技术:　　 分别检测细胞内过氧亚硝基(ON00-)、活性氧簇(ROS)及超氧阴离子(02.-)的含量。　　 研究结果：　　 1.LPS对hASMCs细胞内TNFα产生的诱导具有时间-剂量依赖性:LPS(＞10ng/ml)能够诱导hASMCs细胞内TNFα的释放，且TNFα释放量随LPS刺激剂量增加或时间延长而增大。细胞受LPS刺激后能引起TNFα的快速释放，但刺激超过24小时，其TNFα释放量增加幅度有所减小;刺激超过48小时，其增加幅度减小更加明显。　　 2.LPS通过激活iNOS增加入主动脉平滑肌细胞内TNFα的表达量:　　 LPS能够诱导hASMCs细胞TNFα的释放，但加入iNOS抑制剂(AG或1400W)后，此过程被抑制，TNFα的分泌量减少大约70～80％，证明LPS通过激活iNOS增加入主动脉平滑肌细胞内TNFα的表达量。　　 3.LPS能够同时上调入主动脉平滑肌细胞内ArgⅠ和iNOS的表达:　　 细胞在LPS的刺激下，无论基因还是蛋白水平ArgⅠ和iNOS均随LPS刺激而升高，但ArgⅠ的升高速度落后于iNOS。iNOS的mRNA水平在8小时达到高峰，而ArgⅠ的mRNA水平在12小时达到高峰，之后二者的增幅出现回落;在蛋白表达水平，iNOS在LPS的刺激下表现为持续升高，而ArgⅠ在LPS刺激超过48小时后其蛋白水平开始下降。　　 4.ArgⅠ与iNOS之间存在底物竞争:　　 与上述趋势一致的是，两种酶的催化活性也随LPS刺激而升高。但与NOS活性持续升高不同的是，精氨酸酶活性在48小时后明显下降。而且，当精氨酸酶活性降低时，NOS活性反而有小幅升高。在预先向培养基中加入二者的共同底物L-精氨酸后，两种酶的催化活性在LPS作用12小时后均有所增加，这种升高趋势一直持续至72小时。　　 5.ArgⅠ能够抑制TNFα的生成和单核细胞的趋化和迁移:　　 精氨酸酶Ⅰ能够明显抑制LPS诱导的入主动脉平滑肌细胞TNFα的释放，而精氨酸酶Ⅰ抑制或干扰则能加剧TNFα的释放。经LPS诱导后的入主动脉平滑肌细胞，单核细胞向其趋化和迁移的能力明显增加。而提高精氨酸酶Ⅰ的表达则能降低单核细胞的这种趋化和迁移能力，反之，则加剧单核细胞的迁移和趋化能力的增加。　　 6.ArgⅠ通过与iNOS竞争共同的催化底物来抑制平滑肌细胞NO的释放:　　 免疫组化结果显示在入主动脉平滑肌细胞中精氨酸酶Ⅰ和iNOS在空间上存在很大程度的共定位;升高精氨酸酶Ⅰ能够加剧LPS诱导的NO的释放，而抑制或干扰精氨酸酶Ⅰ的表达，则能逆转这一现象;但升高精氨酸酶Ⅰ却未能对iNOS的表达量造成影响，提示精氨酸酶Ⅰ通过与iNOS竞争共同的催化底物L-精氨酸来抑制NO的释放，而非通过减少iNOS的表达量。　　 7.ArgⅠ能够减少入主动脉平滑肌细胞内ROS、02.-以及ON00-的生成:增加入主动脉平滑肌细胞内的精氨酸酶Ⅰ表达能够抑制LPS对细胞内ROS、02.-及ON00-的生成的诱导;抑制iNOS的活性同样能够抑制细胞内02.-及ON00-的生成增加，而未能对ROS的生成产生明显影响。　　 8.ArgⅠ通过抑制NF-kB的激活降低TNFα的生成:　　 LPS能够引起NF-κB的激活，而后者的激活则能引起细胞内TNFα的生成。精氨酸酶Ⅰ过表达能够通过抑制NF-kB的激活降低TNFα的生成。　　 9.ArgⅠ能够降低动脉粥样硬化斑块内的炎症反应:　　 局部转染精氨酸酶Ⅰ过表达慢病毒载体能够引起斑块内TNFα、iNOS的表达量及巨噬细胞含量的降低，而抑制精氨酸酶Ⅰ则起到相反的效果。TNFα与SMC的面积比计算结果显示，精氨酸酶Ⅰ能够明显地降低该比值。　　 结论及意义：　　 1.精氨酸酶Ⅰ具有抑制SMC炎症的作用;　　 2.精氨酸酶Ⅰ具有抑制动脉粥样硬化斑块内炎症的作用;　　 3.精氨酸酶Ⅰ的抑炎作用通过与具有促炎作用的iNOS竞争底物，减少了后者催化产物的生成量，从而减少ON00-的生成，进而起到抑制炎症的作用。　　 4.在本实验研究中，我们对ArgⅠ在对入主动脉平滑肌细胞和兔动脉粥样硬化斑块炎症细胞因子分泌中的作用及其机制做了系统的阐述，以期为临床治疗此类疾病提供新的思路和治疗靶点。