论文部分内容阅读
众所周知,A型流感病毒是严重威胁人和动物健康的重要的病原体,近年来A型流感病毒引起流感大流行的潜在威胁引起了广泛关注。PB1-F2是2001年发现的A型流感病毒的重要毒力因子,很多科学家认为,流感病毒所致的高死亡率很可能与多种流感病毒中都存在PBl-F2蛋白有关。在一些病毒株中,PBl-F2定位在线粒体,与线粒体腺苷酸转位分子3(ANT3)和电压依赖的阴离子通道1(VDAC1)结合,改变线粒体膜通透性,释放细胞色素C引起线粒体途径诱导的细胞凋亡；PB1-F2能增强炎症反应,促进继发性细菌感染；同时它能与PB1亚单位相互作用,上调病毒聚合酶的活性。但是,对该蛋白发挥作用及其与宿主相互作用的分子机制还知之甚少。因此进一步研究该分子与宿主蛋白的作用,是研究该蛋白功能的主要方面。酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)是研究蛋白质相互作用、蛋白质功能以及筛选新蛋白质的重要工具。为了发现新的、能够和PBl-F2相互作用的蛋白。我们首先通过PCR方法扩增得到全长PBl-F2基因,然后将其作为目的基因构建筛选时所用的诱饵载体pGBKT7-PBl-F2。将构建的载体转化酵母AH109细胞,检测细胞自激活作用。将购买的人白细胞cDNA文库进行滴度测定和文库扩增。再将pGBKT7-PB1-F2和滴度测定和扩增已达到要求的人白细胞文库顺序转化酵母AH109细胞中,通过营养缺陷培养基进行阳性克隆的筛选,筛选出了9个与PB1-F2阳性相互作用的蛋白质,随后对筛出的阳性克隆进行了酶切鉴定,酵母双杂交回转实验和酵母滤纸半乳糖苷酶活性实验,对获得的相互作用在酵母细胞中进行了进一步验证。最后借助数据库中的BLAST工具对筛选阳性克隆的测序结果进行同源性分析,确定了发生相互作用的蛋白质,其中包括SNRK(Homo sapiens SNF related kinase), ANXA11(Homo sapiens annexin A11),PASK (Homo sapiens PAS domain containing serine/threonine kinase), ADRBK1(Homo sapiens adrenergic, beta, receptor kinase 1), FTL (Homo sapiens ferritin, light polypeptide,mRNA),UGP2(Homo sapiens UDP-glucose pyrophosphorylase 2),Gβ2 (Homo sapiens guanine nucleotide binding protein (G protein)beta polypeptide 2),PLAUR(Homo sapiens plasminogen activator,urokinase receptor),PLSCR1 (Homo sapiens phospholipid scramblase 1)。G蛋白是一组具有GTP结合、水解活性的蛋白质,在细胞膜受体和效应蛋白之间的信息传递过程中起中介作用,是细胞内一类重要的信号转导蛋白。G蛋白信号的转导参与病毒感染的进程与疾病的发生相关联。鸟嘌呤核甘酸结合蛋白β多肽2(Gβ2)是异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚单位的成员,是一种WD40结构重复的多功能蛋白,在线粒体融合等方面发挥重要的作用。虽然目前关于Gβ2的研究报道较多,但其在流感病毒感染方面还未见报道。我们选择Gβ2蛋白作为进一步研究的目的蛋白,并通过GST pull-down、免疫共沉淀方法验证二者在体外和体内也能够发生相互作用。应用PB1-F2突变体的体外结合实验表明PB1-F2突变体各段均与Gβ2发生相互作用。Gp2与PB1-F2相互作用的研究在分子水平上探索PBl-F2蛋白的新功能,本研究结果也提示了G蛋白信号通路可能在流感病毒感染过程中发挥作用,为进一步研究A型流感病毒PB1-F2蛋白的作用机制及流感病毒致病机理奠定了基础。