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目的 神经生长因子（NGF）作为神经营养因子家族的一员，对神经元存活、生长、发育与分化、损伤修复与再生等方面具有重要作用，它还参与免疫反应，具有促进创伤愈合和血细胞生长，促进肿瘤分化、抑制肿瘤生长等作用。由于天然的NGF来源少，不能满足临床和科学研究的需要，因此，用基因重组技术来获得大量高活性的人NGF蛋白已成为当务之急。本研究对人含前导肽的β-NGF基因序列进行PCR扩增，直接插入pGEM-T载体进行亚克隆，并对所构成的重组子pGEM-Tβ-NGF进行分析鉴定。把亚克隆的β-NGF基因插入分泌型酵母表达载体pPIC9K中，构成重组表达质粒pPIC9Kβ-NGF，将其转化入Pichia pastoris酵母GS115菌株中进行表达，以获得具有高生物活性的神经生长因子蛋白，为下一步临床应用打下基础。 方法 （1）用酚/氯仿/异丙醇方法从人胎盘中提取总DNA。 （2）采用PCR技术，根据β-NGF基因序列设计一对特异引物，用Taq+pfu DNA聚合酶从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导肽及信号肽的β-NGF基因序列。 （3）采用A-T克隆法，在T4DNA连接酶存在的条件下，把从PCR产物中纯化所得到的β-NGF基因与pGEM-T载体直接连接后，转化入用氯化钙法制备的JM109感受态菌中，经蓝白斑试验筛选，得到白色的阳性转化菌株。转化菌株经过扩大培养后，经提取后得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF。用双酶切法、PCR法及序列分析对重组子pGEM-Tβ-NGF进行鉴定。 （4）将亚克隆所得到的重组质粒pGEM-Tβ-NGF和酵母表达载体pPIC9K分别同时用内切酶SnaBⅠ和AvrⅡ进行双酶切，所得到的两段目的片段进行连接，得到重组表达质粒pPIC9Kβ-NGF。用SacⅠ对其进行线性化，用脂质体法将其导入GS115中，在组氨酸缺失的RD平板上筛选出阳性菌株。用PCR法对这些菌株进行筛选和Mut+/Mut‘表型的鉴定。 （5）选取含有Mut十的转化子的单菌落，放人以甲醇为唯一碳源的BM-MY培养液中，培养3一4天，每24小时加人一次甲醇，使终浓度为0.5%，以维持甲醇的浓度，诱导其表达和分泌蛋白。 （6）用SDS一PAGE电泳对表达蛋白进行分析，用Westem blotting方法对所表达蛋白进行免疫活性鉴定。结果 （l）从人胎盘中提取的总DNA，其OD，/OD280“1 .8。 （2）用一对特异引物，采用PCR法，从人胎盘总DNA中扩增出的产物，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，结果显示，在748bp处有一条阳性目的条带。对其纯化产物进行双向测序，结果显示与文献报道的p一NGF序列相同，未发生碱基的突变。 （3）亚克隆中，从蓝白斑试验中所得到白色转化菌株中提取的重组质粒pGEM一T日一NGF，经h吐I酶切（pGEM一T载体上有2个乃瓜11酶切位点）后，得到了预期的2564bp和1 185bp两条带;用这些白色菌落分别作为PcR反应的模板，反应产物经1 .2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748位置上出现了阳性条带;用，I7及SP6作为测序引物，对重组子pGEM一Tp一NGF进行测序，其碱基序列与文献报道相同。 （4）在叭DNA连接酶作用下，带有互补粘性末端的p一NGF和pPIcgK连接后，形成重组质粒nPICgKp一NGF。用。一factor和3’Aoxl引物（儿t中提供）作为测序引物，对nPICgKp一NGF进行双向测序。结果表明，p-NGF基因已正确插人pPICgK载体，序列与文献相同，没有突变和错配，且其翻译启动子已正确插人pPICgK载体的阅读框架。 （5）为了增加外源DNA的同源整合机率，用Sacl线性化重组表达质粒pPICgKp一NGF。，用脂质体法将其导人酵母菌株Gsl巧。阳性菌株筛选和Mut+/Mut‘表型的鉴定采用PCR法。以5‘AOXI及3‘AOXI序列引物为引物的PCR产物，如果在出现1 .ZKb左右的包含插人子在内的阳性片段的同时，在2.ZKb的位子上也出现一条带，说明宿主菌的AOXI基因未被破坏，为Mut+表型，反之，为Mut.表型。 （6）4个Mut+性菌落在BMMY培养液中经30℃振摇、甲醇诱导后，所表达的蛋白经SDS一PAGE电泳染色显示，72h及%h的上清样品在14.OKD左右有一条特异条带。 （7）用Westem bfotting鉴定，采用兔抗鼠NGF多克隆抗体进行免疫组化染色，显示在14.OKD有特征带。经积分扫描分析，表达目的蛋白占细胞外泌总蛋白的30%。结论 （l）用酚/氯仿/异丙醇方法提取的人胎盘DNA纯度较高。 （2）用Taq+nfu DNA聚合酶所扩增出来的PCR产物可靠，未出现碱基突变。 （3）用CaCI:法制备的JM109感受态菌有很好的转化率。 （4）亚克隆的重组质粒pGEM一Tp一NGF构建成功。 （5）制备的脂质体具有较好的转化能力。 （6）重组表达质粒pPICgKp一NGF构建成功。 （7）用PCR法同时对阳性转化菌株的筛选和Mut+/Mut，表型的鉴定具有简便、可靠的优点。 （8）piehia pastoris酵母GSI 15菌株对p一NGF蛋白的表达在72小时以后开始稳定表达。 （9）Pichia Pastoris酵母所表达的自身的外泌蛋白较少，使分泌的目的蛋白易于提纯。 （10）Pichia pastoris酵母所表达的蛋白有较高的表达率。 (川所表达的p一NGF蛋白具有免疫活性。