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猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种猪的呼吸道疾病,该病呈世界性流行,主要以纤维素性肺炎和出血性肺炎为特征,具高发病率和死亡率,给全世界养猪业造成严重的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌具有多种毒力因子,包括Apx毒素、荚膜多糖（CP）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（Tbp）、黏附素及蛋白酶等,其中Apx毒素包括Apx Ⅰ、Apx Ⅱ、 ApxIII和ApxIV已被证实在APP感染致病过程中起到重要作用,并且Apx Ⅰ、 Apx Ⅱ、ApxⅡ能诱导产生保护性免疫。目前研究表明Fur蛋白能够调节APP相关毒力因子,与APP致病力有关。因此,鉴于fur基因能影响APP的毒力,为了进一步致弱其毒力,本研究通过同源重组和蔗糖负向筛选的方法,以本实验室构建的APP血清7型S8菌株双基因缺失突变株S8△clpP/△apx ⅡC为亲本菌株,构建了无抗性标记的三基因缺失突变株S8△clpP/△apx ⅡC/△fur,对其生物学特性做了初步研究,并进行了突变株的致病力试验、安全性评价试验和免疫攻毒试验,对其免疫保护效力进行了综合评价,为研究开发APP基因工程弱毒活疫苗奠定了基础,本研究主要内容包括：（1）fur同源臂的扩增与重组转移质粒的构建根据GenBank中公布的血清7型APP S8株fur基因序列（NC010939.1）设计引物,利用引物扩增fur基因的上同源臂furS和下同源臂furX,分别以回收的furS和furX为模板,furSF.furXR为引物重叠延伸PCR扩增出缺失了349bp的fur基因的目的片段furSX,回收纯化后经Sal Ⅰ/Not Ⅰ双酶切后连入到经Sal Ⅰ/Not Ⅰ双酶切的pEMOC2载体中,构建重组转移质粒pEMOC2-furSX。（2）三基因缺失突变株的构建及筛选将重组菌E.coliβ2155（pEMOC2-furSX）作为供体菌,亲本株S8△clpP/△apxⅡC作为受体菌,通过接合转移和氯霉素抗性（CmR）筛选,获得具有CmR的菌株为单交换菌株。经鉴定引物鉴定正确后,挑取单菌落分别影印到Cm抗性平板和10%蔗糖平板上,筛选出氯霉素敏感（Cms）和蔗糖抗性（SurR）的克隆,再用鉴定引物PCR鉴定。核酸凝胶电泳只显示大小为548bp的条带,即可判断该克隆为突变菌株。（3）缺失突变株的生物学特性研究将得到的三基因缺失突变株在体外连续传代培养,通过引物鉴定,表明该缺失突变株能够稳定遗传。生长曲线测定结果表明,各缺失突变株在体外增殖能力没有明显差异,三基因缺失突变株生长前期相对较缓慢,6小时后活菌数达到较高水平,约5xl09CFU/mL,与野生株相当。溶血试验表明,clpP基因缺失后,S8△clpP菌株溶血能力有显著下降；而将主要溶血素ApxⅡ的激活基因apxⅡC缺失后,S8△clpP/△apxⅡC菌株完全丧失溶血能力,与预期相符；而fur基因的缺失则不对菌株溶血能力造成明显影响,仍表现为不溶血。铁摄取利用试验表明,fur基因缺失后,该突变株对铁的摄取利用有所下降,与预期相符,可能是造成缺失株前期生长相对较慢的原因,后期生长不受影响可能是由于其它铁摄取机制的补充。（4）缺失突变株对猪的致病性试验选取月龄（3月）、体重及健康状况相近的APP血清阴性猪36头,随机分为4组,每组9头。各缺失株分别以1×107CUF、1x108CFU、1x109CFU三个梯度以气管接种途径进行攻毒,每头猪攻1mL。攻毒后,连续一周监测猪群精神状况、采食量、呼吸和体温变化。三周后处死试验猪,观察肺部病变。通过临床症状、肺部病变及肺脏细菌载量来评价不同缺失突变株之间的致病性差异。结果表明,三基因缺失突变株S8△clpP/△apxⅡC/△fur毒力显著下降,对仔猪的致病性极显著低于野生株S8菌株。（5）三基因缺失突变株的安全性评价选取日龄（35日）、体重及健康状况相近的APP血清阴性猪6头,随机分为两组,每组3头。分别将三缺失株S8△clpP/△apxⅡC/Afur以1x107CFU和1×109CFU的剂量气管接种,每头猪接种1mL。接种后连续一周监测猪群精神状况、采食量、呼吸和体温变化。两周后处死,通过猪临床指数、肺部病变指数及肺部病理切片来评价三缺失突变株的安全性。结果表明,相差100倍剂量攻毒的两组试验猪均未表现明显临床症状和明显肺部病变,表明该缺失突变株对猪足够安全。（6）缺失突变株对猪的免疫攻毒试验选取日龄（35日）、体重及健康状况相近的APP血清阴性猪24头,随机分为4组,每组6头。第1组设为对照组,2-4组分别将各缺失突变株以1×107CFU的剂量进行气管接种,每头猪接种1mL。一免后21天进行二免,二免后第10天用APP血清7型和血清5型进行攻毒,每个型每组各攻3头猪。结果表明,三基因缺失突变株免疫组对同型血清7型和异型血清5型的攻击均有良好的保护力,临床症状指数和肺部病变指数显著低于对照组和单缺失组,二免后抗体水平和细胞免疫水平显著高于对照组,而对照组对血清7型和血清5型都没有保护力。