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南瓜属(Cucurbita)植物起源于美洲,种类丰富,用途广泛,是世界上非常重要的蔬菜作物之一。目前,栽培种大部分都是蔓生品种,其蔓较长,有的可长达15米,在栽培和管理过程中存在许多不便。矮化植株因其高产,便于果实采收,节省土地资源和劳动力的优势,近年来一直受研究者的青睐。矮生资源也成为了非常宝贵的种质资源。本研究以一个新的矮生印度南瓜为材料,对其进行遗传学分析,用AFLP技术寻找与南瓜短蔓基因连锁的分子标记,并用cDNA-AFLP(cDNA Amplified Fragment Length Polymorphism)技术对其植株节间的基因表达进行分析,同时,采用RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Reaction)技术对蔓伸长的相关差异表达片段(Transcript Derived Fragments TDFs)在不同发育阶段的营养组织和生殖组织中的表达情况。主要研究结果如下:
1.进行了短蔓性状的遗传学分析
该矮生材料由于极少出现雌花,所以在有长蔓植株和短蔓植株的株系里,以长蔓株为母本,短蔓株为父本杂交,或长蔓植株自交,后代分株系种植,对它们的后代分离情况进行统计分析。用长蔓株和短蔓株杂交,如果F1全是长株,自交F2长蔓、短蔓株符合3:1分离比例;如用短蔓植株与F1回交,下一代长蔓、短蔓株符合1:1分离比例。多代、多株系的试验结果均如此。表明该短蔓性状由一对隐性核基因控制。
2.建立与优化了南瓜AFLP体系
以南瓜长蔓株和短蔓株为材料,通过优化选择性扩增重要因素:Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶的用量、预扩产物稀释倍数,确立了适用于南瓜AFLP的最佳反应体系,为后续实验奠定了基础。
3.获得了与短蔓基因连锁的分子标记
用64对MseI/EcoRI引物组合,找到了一个与矮生基因相连锁的分子标记。该标记在短蔓植株与杂合植株中都出现,在纯合长蔓植株中不出现。对该标记片段进行回收、克隆、测序,该片段长度为149bp。与杨树CBL-interacing蛋白激酶有96%的同源性。
4.进行了长蔓和短蔓植株基因表达差异的cDNA-AFLP分析
利用cDNA-AFLP技术比较分析了长蔓植株和短蔓植株的基因表达差异,获取了120条TDFs,成功回收到94条,并进行测序,在Blastx数据库中比对,发现这些片段代表的基因分别涉及细胞壁合成与调控、电子传递和能量途径、转录调控和信号转导、防卫与胁迫反应、普通新陈代谢、蛋白质代谢、转运通道等方面。
5.分析了部分蔓伸长相关基因表达模式的RT-PCR
选取7个基因片段进行了RT-PCR验证,发现4个基因片段与cDNA-AFLP的分析结果相同,都在短蔓植株茎节中特异表达,同时对上述4个差异片段在短蔓植株上进行差异表达分析,发现这4个片段在短蔓植株的不同组织中有不同的表达模式。