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该论文以5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosp-hate Syntheses简称EPSP合酶)为研究对象,以克隆新的EPSP合酶和鉴定EPSP合酶基因中草甘膦抗性相关位点为目的来进行研究,以获得拥有自主知识产权的抗性基因.采用免培养技术提取极端草甘膦污染土壤的总DNA,利用Sau3AI酶进行部分消化并与载体连接转入EPSP合酶缺陷型大肠杆菌ER2799感受态细胞中而构建形成土壤总DNA的基因文库.通过EPSP合酶互补实验获得了一株草甘膦耐受菌株ERAM1,检测其耐受草甘膦浓度高达150mM,将该菌株重组质粒的外源插入片段进行测序,结果显示该插入的外源片段总长度为3.6kb,其中含有一个454个氨基酸序列的阅读框架,该基因与美国草甘膦抗性相关的美国专利(专利号6,225,114)涉及Escherichia coli,Salmonella typhimueium,Arabidopsis thaliana,Aeromonas salmonicida,Brassica napus,Aspergillus nidulans的aroA基因核苷酸序列和氨基酸序列几乎没有同源性,与美国专利(专利号6,248,876)所提到Achromobacter sp.LBAA,Agrobacterium sp.CP4,Pseudomonas sp.PG2982,Staphylococcus aureus的aroA基因氨基酸同源性在45％以下,但与Bacillus subtilis的aroA基因氨基酸同源性比较接近(56%).表明我们所克隆的基因是一个结构比较新颖的EPSP合酶基因,并且具有较高的草甘膦抗性.利用来源于已有的高抗草甘膦菌株(草甘膦浓度高达500mM)炭光假单胞菌G2的EPSP合酶基因序列设计引物,直接对未经草甘膦污染的土壤稀释培养的单菌落进行PCR来研究细菌抗草甘膦机理.通过分析PCR扩增结果获得一株能够扩增出1.35kb片段的菌株即L35菌株,草甘膦抗性分析发现该菌株在草甘膦浓度高于350mM时不能生长而G2菌株在该草甘膦浓度下能很好生长,说明L35菌株草甘膦抗性明显低于G2菌株的草甘膦抗性.L35菌株的16s rRNA基因分类结果显示L35和G2为同一属,均为假单胞菌.EPSP合酶基因测序结果显示L35与G2的EPSP合酶基因只有两个碱基的差异,氨基酸也相应地发生了两个碱基的变化即Ser-83和Asp-94,此变化的氨基酸位点不在美国保护专利范围内.对L35进行二级结构预测及高级结构比较发现,发生变化的氨基酸位点恰好位于酶与底物结合部位,但不属于关键部位.证明了的确存在一些菌株其本身就有草甘膦抗性特性,在环境诱导下,EPSP合酶基因发生突变使草甘膦抗性增高.,将ERL1 35、G2和ERAM1三种菌株的EPSP合酶基因的碱基序列和氨基酸序列比较发现,三者的碱基序列的同源率为57.46%,而氨基酸的同源率为42.24%,说明三者EPSP合酶基因具有明显的差异.以上研究发现,影响菌株草甘膦抗性的EPSP合酶基因突变位点位于EPSP合酶的第1、2和3区域,说明此三个区域位于EPSP合酶与底物结合的关键区域.