中文摘要目的肿瘤的侵袭和转移是肿瘤发展过程中的一个重要组成部分，也是威胁患者生命的主要原因。肿瘤细胞要实现侵袭和转移，必须首先突破由基底膜(basement membrane，BM)和细胞外基质(extraeellular matrix，ECM)构成的组织屏障。近来研究发现，肝素酶(heparanase，Hpa)不仅可以特异性地降解该屏障的主要成分之一——硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfateprotoglycan，HSPG)，还能协同多种生物因子(如bFGF等)，通过多条途径直接和间接地促进肿瘤的生长、侵袭和转移，因而成为近年来肿瘤转移机制和对策研究的热点。肝素酶在正常组织中的表达很有限，而在多种肿瘤中的表达则明显高于其来源的正常组织，但这种表达改变的普遍性及其对于肿瘤的早期诊断和预后评估的意义仍有待研究。目前关于肝素酶在肿瘤组织中的表达情况及其与生物活性因子bFGF的相互关系的研究尚少，为此，本实验对人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)组织中肝素酶和bFGF的表达情况及其与临床病理因素和患者术后生存时间的关系进行分析，以探讨它们在肺癌转移及患者预后评估中的作用和意义。材料与方法1．材料115例非小细胞肺癌组织蜡块来自辽宁省鞍山肿瘤医院1980年至2001年和中国医科大学附属第一临床医院2001年到2002年间手术切除的肺癌组织；同时取45例癌旁正常肺组织作对照。组织经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋。40例新鲜非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织取自中国医科大学附属第一临床医院胸外科2001年9月到2002年3月间手术切除的标本。2．主要试剂和来源实验药品：浓缩型小鼠抗人heparanase单克隆抗体(H-130)由以色列Insight公司惠赠；兔抗人bFGF多克隆抗体、即用型streptavidin-peroxidase(S-P)超敏免疫组化(KIT-9710)、DAB显色试剂盒(DAB-0031)均购自福州迈新生物技术开发公司；肝素酶原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程公司(产品编号MK2156)；碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG二抗(IE0071)和NBT／BCIP显色试剂盒(NBS82112)购自华美生物技术公司；梯度蛋白标准(10748-010)购自Invitrogen公司。3．方法3．1 免疫组织化学染色：检测人肝素酶蛋白表达采用链菌素抗生物素蛋白一过氧化物酶免疫组化法(S-P法)，用PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：以细胞膜和／或细胞浆中出现棕黄色颗粒为肝素酶阳性显色，以染色强度和阳性细胞比例评定阳性表达。染色强度分级如下：无着色为0，淡黄色为1，黄色及更深颜色为2；阳性细胞数分级为：阳性细胞数≤50％为O，51％～75％为1，≥76％为2。两项得分相乘结果≥2为阳性表达病例。3．2 Western Blot：检测肝素酶在正常肺组织和非小细胞肺癌中的表达。取新鲜样品(1-2)克加5倍湿重的裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳、转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。结果判定为转印膜上出现清晰的蓝紫色蛋白条带，并对蛋白条带作灰度值测定。3．3 原位杂交：检测人肝素酶mRNA在正常肺组织和非小细胞肺癌中的表达，探针由武汉博士德生物公司设计合成，杂交方法按试剂盒说明书进行。结果判定以癌细胞群中≥10％的细胞浆呈淡黄至黄色染色为阳性表达。4．统计学分析采用SPSS 10.0统计分析软件，采用t检验、X~2检验，0.01<P<0.05有统计学差异，P≤0.01为有显著统计学差异。对生存数据采用Kaplan-Meier分析并绘制生存曲线，用Log-rank检验差异性；用Cox模型进行多因素分析，P≤0.1者为有意义。结果1．肝素酶在正常肺组织及非小细胞肺癌中的表达肝素酶蛋白在非小细胞肺癌组织中定位于癌细胞膜和／或细胞浆，以膜着色尤其明显，在癌巢边缘及基底膜处染色明显增强；在正常肺支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中为阴性表达，而在淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞中呈不同强度的阳性表达。原位杂交检测结果显示：肝素酶mRNA在癌细胞浆中呈淡黄色至黄色着色，在淋巴细胞和巨噬细胞的细胞浆中呈黄色至棕黄色染色，而在结缔组织及正常肺上皮细胞中无表达；原位杂交检测的阳性表达病例与免疫组化结果相一致。Western blot结果显示：肝素酶在40例非小细胞肺癌及其对应的癌旁组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织，分子量约为50kDa。2．bFGF在肺癌和癌旁正常组织中的表达bFGF在肺癌组织的癌细胞浆内呈黄色至棕黄色染色，在癌细胞基底膜处偶见弱阳性染色。正常组织中，bFGF仅在成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞中有弱至中等强度的染色，而在肺泡上皮和支气管上皮细胞中均为阴性表达。3．肝素酶、bFGF蛋白的表达与NSCLC临床病理特征关系分别对肝素酶和bFGF的表达情况及其与NSCLC临床病理特征的相互关系进行统计学分析：肝素酶与肺癌的分期、淋巴结转移、血管浸润和MVD相关，与肺癌细胞的分化程度无关；bFGF的表达与肺癌的分期、淋巴结转?