目的:黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤。在黑色素瘤的不同亚型中,研究最为广泛的是欧洲人中高发的皮肤黑色素瘤(Cutaneous melanoma,CM),而黏膜黑色素瘤多发于亚洲人群且大多出现在身体不受阳光照射的区域。但迄今为止只有少数亚型黏膜黑色素瘤的分子特征被揭示。因此,我们利用外显子测序来探究妇科黏膜黑色素瘤(Gynecological mucosal melanoma,GM)的基因突变谱进而阐述其疾病发展的可能机制。方法:1.对肿瘤组织进行二代测序(Next generation sequencing,NGS)以探究外显子区域突变;2.通过荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)和 C-circle实验验证端粒替代延长机制(Alternative lengthening of telomeres,ALT)的存在;3.免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)研究ATRX蛋白的表达情况;4.液滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测 TERT 拷贝数变异。结果:通过对32例妇科黏膜黑色素瘤样本进行外显子测序,发现了与ALT相关的ATRX的频繁突变。在所有58份样本中,ALT阳性33例(56.9%),其中23例出现ATRX蛋白缺失。此外,GM样本中均未检测到TERT启动子突变(n=40);但在20%(7/35)的标本中存在TERT区拷贝数增加,且TERT扩增与ALT阳性互斥(P<0.05)。Kaplan-Meier分析进一步显示,相对于TERT扩增来讲,ALT阳性与无转移GM患者的生存期延长有关。结论:端粒维持机制(Telomere maintenance mechanisms,TMMs)在GM的发生发展中起重要作用,这可能有助于预测GM患者的临床预后和靶向治疗效果。目的:构建PBRM1敲除的肝癌细胞系并探究PBRM1在肝癌发生发展中的功能。方法:应用CRISPR/Cas9系统在Huh7细胞中靶向敲除PBRM1基因。采用Sanger测序检测目的区域的敲除情况,Western blot检测蛋白的表达。通过转录本测序(RNA-seq)比较 Huh7 敲除(Knock-out,KO)细胞系与 Huh7 野生(Wild-type,WT)细胞系基因表达谱,富集差异表达基因。使用流式细胞术分析细胞周期的改变。CCK-8实验和克隆形成实验探究细胞增殖情况。此外对Huh7-KO细胞系和Huh7-WT细胞系进行不同浓度的γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)培养,验证GO富集中IFN-γ应答通路的改变。结果:测序结果显示PBRM1被成功敲除,且在Huh7-KO细胞系中未检测到PBRM1蛋白表达。Huh7-KO细胞的生长速度和克隆形成率均显著慢于Huh7-WT细胞(P<0.0001)。GO和KEGG功能富集分析发现下调基因主要与细胞周期相关,包括DNA复制、染色体分离、核分裂等;上调基因主要与免疫应答相关,包括适应性免疫应答,对IFN-γ应答等。Huh7-KO细胞系种处于G1期细胞的比例显著高于Huh7-WT(P=0.0166),而前者处于S期的细胞比例明显低于后者(P=0.0002)。另外,PBRM1缺失使细胞对高浓度IFN-γ的杀伤作用更敏感(P=0.0091),验证了 GO富集中Huh7-KO细胞系对IFN-γ应答的改变。结论:肝癌细胞系Huh7中敲除PBRM1可以引起G1/S期阻滞从而抑制细胞增殖。同时,PBRM1缺失影响肝癌细胞对IFN-γ刺激的响应。这些发现可为PBRM1缺失型肝癌患者的免疫治疗提供新思路。