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随着化石能源的不断消耗以及能源危机的爆发,开发绿色、可再生能源已成为本世纪关系国计民生的重大举措。氢气作为一种新型能源载体,是目前地球上最为理想的清洁燃料之一。相比传统制氢方法来说,微生物发酵制氢通过利用多样的工农业废弃物,例如秸秆类纤维素物质,工业废水、污泥等作为发酵底物合成生物氢,在生产方式上更具经济可行性。本研究针对课题组前期研究工作中获得的一株产氢细菌Enterobacter cloacae WL1318,研究该菌株发酵棉秆水解糖液产氢的影响因素,获得优化的发酵产氢条件。进一步针对主要的产氢影响因素进行发酵过程的调控。在此基础上,对E.cloacae WL1318发酵棉秆水解糖液产氢过程进行代谢通量分析,弄清生物氢合成支路和竞争代谢支路的代谢流分布,弄清主要的调控节点。同时,克隆影响菌株生物氢合成的甲酸-氢裂解酶转录激活因子fhlA基因,构建原核表达载体,获得的研究结果如下:（1）起始糖浓度、发酵温度、起始pH值对E.cloacae WL1318发酵棉秆水解糖液产氢过程中生物氢的合成、还原糖的利用及菌体的生长均有显著影响。当起始糖浓度为40 g/L、起始pH值为7.5、发酵温度为37℃时,菌株获得最高的日均产氢量和累积产氢量,葡萄糖和木糖利用率、菌体生长亦较高,为此可确定为最佳的发酵产氢条件。在E.cloacae WL1318发酵棉秆水解糖液产氢过程的pH调控下,分段调控pH值可避免发酵液pH值的急剧下降,有利于生物氢合成和菌体生长,但对棉秆水解糖液中葡萄糖和木糖利用的影响均不显著。分段调控pH值处理的产氢潜力P均高于未调控处理的,48 h调pH值的处理能使日均产氢量较未调控处理的提高约1.5倍;24 h调p H值和48 h调pH值处理的累积产氢量相较未调控处理的提高约15%和30%。分段调控p H值对E.cloacae WL1318发酵棉秆水解糖液产氢过程中的菌体生长有较大影响,使其在调控时间点后达到活菌数峰值,且菌体生长OD600 nm在调控时间点后均高于未调控处理的。（2）在E.cloacae WL1318发酵棉秆水解糖液产氢的发酵周期内,葡萄糖、木糖及木酮糖的绝对和相对代谢通量逐渐降低,说明葡萄糖及木糖有效地进行了代谢,推动了菌株细胞物质的合成和发酵途径的进行。发酵24 h,丙酮酸脱羧酶活性和丙酮酸的代谢通量均较高,之后缓慢下降,说明丙酮酸在快速地进行脱羧转化,为其它代谢支路提供了碳骨架。柠檬酸在发酵24-48 h有较高的代谢通量,说明此时丙酮酸节点的代谢流部分流向三羧酸循环。乳酸合成支路在发酵48-96 h竞争生物氢合成的代谢流分布,此时乳酸代谢通量和乳酸脱氢酶活性均较高。乙醛脱氢酶活性在发酵48 h-96 h较高,且乙醇代谢通量在发酵120 h有一定提高,说明乙酸和乙醇合成的代谢支路在发酵后期对生物氢合成起到了较主要的竞争作用。（3）以E.cloacae WL1318基因组DNA为模板,根据GeneBank中Enterobacter cloacae及近缘种的fhlA基因序列设计引物,以FF1和FR1为上下游引物,扩增fhlA基因,目的片段切胶回收后,以FF2和FR2为上下游引物,亚克隆fhlA基因,并连接到原核表达载体p ET-28a中。生物信息学分析fhlA基因的核苷酸序列全长为2060 bp,有1212 bp完整开放阅读框,编码氨基酸403个,通过Blastp比对构建进化树发现该蛋白属于甲酸-氢裂解酶转录激活因子,为胞内蛋白。通过双酶切以及测序验证,证明其成功连接到原核表达载体p ET-28a中,为后续对重组菌株的构建奠定了实验以及理论基础。