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目的:HLA半相合造血干细胞移植可以使大部分患者找到亲缘移植供者,但因病人易发生致命的GVHD常导致移植失败,使其应用受到限制。骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的非造血干细胞,能够分泌多种细胞因子参与造血微环境的组成,为造血干细胞的分裂、增殖、分化提供适合的环境,并在免疫调节方面发挥重要作用。有研究发现,异基因造血干细胞移植时共同输入供体间充质干细胞可以降低移植失败率并减轻GVHD。本实验拟将骨髓MSC辅助用于主要组织相容复合体(MHC)半相合小鼠HSCT中,利用MSC的免疫调节作用,探索不同数量的BMMSC在半相合HSCT中对aGVHD的影响,为减轻MHC不完全匹配HSCT中的aGVHD提供实验依据。方法1实验动物骨髓细胞及MSC供鼠清洁级C57BL/6H-2b(B6),6-8周龄,体重16.74±0.86克,雌雄兼用;受鼠清洁级CB6F1H-2d×b(BALB/cH-2d×C57BL/6H-2b),19.74±1.75克,雌雄兼用,以上动物由河北省实验动物中心提供。动物饲养于百级无菌层流架内,饲料经高压处理后放入饲养箱。2 BMMSC的分离培养将MSC供鼠(B6)断椎处死后,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,用含10%的胎牛血清的F12培养液冲出骨髓,常规制备骨髓MNC后置于一次性塑料培养瓶,在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。72小时后去除悬浮上清,换液。此后每3-4天换液一次,当贴壁细胞层达到90%以上融合时,以0.25%胰酶消化,传至第3代以后的细胞,纯度>90%用于移植。3建立MHC半相合移植动物模型3.1供鼠细胞的分离将供鼠(B6)断椎处死后,立即浸入75%酒精浸泡2～3分钟,无菌条件下分离脾脏、双侧股骨、胫骨。常规制备骨髓、脾脏MNC。锥虫蓝计数,拒染率>95%;调整细胞数待用。3.2 T细胞检测FCM法以mCD3-PE抗体测定脾MNC中T细胞含量。3.3动物分组①诱导GVHD组:CB6F1尾静脉注入B6BMMNC(3×106)+B6脾MNC1×107;0.4ml/只;②高剂量联合MSC移植组:CB6F1尾静脉注入B6BMMNC(3×106)+B6脾MNC1×107+B6BMMSC1×106;0.4ml/只;③低剂量联合MSC移植组:CB6F1尾静脉注入B6BMMNC(3×106)+B6脾MNC1×107+B6BMMSC1×104;0.4ml/只;④TBI对照组:CB6F1尾静脉注入生理盐水0.4ml/只。每组动物6～8只(不包括在移植后不同时间活杀,留取血清标本的动物),每组实验重复2次。3.4移植动物处理供受鼠均于移植前3天开始饮用盐酸酸化水;受鼠于移植当天接受60Coγ射线致死性全身照射(TBI)12Gy,剂量率为6.3cGy/min,4小时内按移植分组要求进行细胞注射,-1d与移植后隔天测体重并由尾静脉取血计数白细胞。于-1d、+7d、+21d、+42d摘眼球法取小鼠静脉血,2000转/分离心10分钟后分离血清,储存于-80℃冰箱内保存备用。同时留取病理标本。4 aGVHD的判断移植物植活:连续两次WBC>1×109L-1;移植失败:动物死亡时WBC≤1×109L-1,或+15d后WBC≤1×109L-1;WBC>1.5×109L-1并伴有以下症状5种以上的定为GVHD:精神萎靡、翘毛、脱毛、皮损、腹泻、弓背、眼炎、体重骤减甚至死亡。上述症状在+10d内出现为超急性GVHD;+10d～+60d出现为aGVHD。病理改变:肝细胞水肿伴有灶性坏死,汇管区及中央静脉和肝血窦扩张、淤血,肝窦及汇管区内有较多的分叶核细胞浸润,脾脏结构破坏,有巨噬细胞浸润。5 ELISA测定IL-6、IFN-γ取-1d、+7d、+21d、+42d血清测定,方法按使用说明书要求。6统计学处理SPSS11.5软件分析,分组资料以均数士标准差表示,进行t检验;绘制Kaplan-meier生存曲线。结果1脾MNC中T细胞含量:约50%。2 MSC对aGVHD的影响2.1 MSC对动物aGVHD出现的影响高剂量联合移植组GVHD的出现时间较诱导GVHD模型组明显延迟(41.75±6.25d&19.20±6.05d),有统计学意义,P<0.001;而低剂量联合移植组GVHD的出现时间较诱导GVHD模型组明显提前(8.13±2.30d&19.20±6.05d),有统计学意义,P<0.001。2.2 MSC对aGVHD动物生存期的影响高剂量联合MSC移植组小鼠生存时间与GVHD组比较P>0.05,无统计学意义,还不能认为高剂量联合移植可以延长aGVHD动物生存时间;低剂量联合MSC移植组小鼠生存时间与GVHD组比较(19.58±2.21d&34.19±6.82d),P<0.01,有统计学意义,可认为低剂量联合移植加速动物死亡。2.3 MSC对动物体重的影响GVHD的发生伴随着受鼠体重的下降,高剂量联合移植组平均体重下降至最低点的时间较GVHD组明显延后(+28d&+48d),而单纯照射和低剂量联合移植组小鼠体重持续下降直至全部死亡。2.4 MSC对动物造血恢复的影响联合MSC移植对细胞平均植入(外周血连续2天WBC>1×109L-1)时间无明显影响,在+6d全部小鼠WBC>1×109L-1。2.5病理观察三组GVHD发生时的病理改变基本一致。2.6 MSC对移植后血清IL-6、IFN-γ水平的影响2.6.1血清IL-6水平变化正常情况下血清IL-6水平较低(5±0.01pg/ml),+7d高剂量MSC联合移植组血清IL-6浓度较诱导GVHD组明显升高(75±17.5&25±10pg/ml),P<0.001,有统计学意义;低剂量MSC联合移植组血清IL-6浓度较诱导GVHD组明显减低(7.5±5&25±10pg/ml),P<0.001,有统计学意义;到+21d、+42d时三组间IL-6水平无明显差异。2.6.2血清IFN-γ水平变化正常小鼠血清IFN-γ浓度较低(2.5±0.01pg/ml),+7d高剂量MSC联合移植组血清IFN-γ浓度与诱导GVHD组比较无统计学意义;低剂量MSC联合移植组血清IFN-γ浓度较诱导GVHD组明显升高(64±7.5&15±5pg/ml),P<0.001,有统计学意义;+21d高剂量联合移植组血清IFN-γ水平较诱导GVHD组明显低,P<0.001,有统计学意义(80±6.7&265±6.5pg/ml)。+42d高剂量联合移植组与诱导GVHD组IFN-γ水平无显著差异。结论1大剂量联合MSC移植延缓MHC半相合小鼠HSCT中GVHD的发生,而小剂量联合MSC移植有加重GVHD发生的趋势;2 MSC在移植后一定时间内可通过一定途径抑制IFN-γ的分泌、促进IL-6的分泌,这可能是MSC减轻GVHD的作用机制之一。