随着蛋白质组的研究向深度覆盖定性鉴定和规模化的定量分析方向发展,对蛋白质组学技术提出了新的要求。蛋白质组深度覆盖的含义包含两个层次:蛋白质组中蛋白质鉴定种类的深度覆盖和蛋白质序列的长度覆盖。要实现蛋白质组深度覆盖和规模化定量,其方法学策略主要有两个:一个是使用高分辨率、高灵敏度和高扫描速度的质谱;另一个是提高液相色谱的分离度。本论文从提高液相色谱分离度入手,分别制备了粒径为3 μm和1.7 μm的新型反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料,并将其用于蛋白质组学研究中。一方面,解决了单一色谱模式无法将化学性质相近的肽段有效分离以及肽段疏水性太强引起的不可逆吸附的问题;另一方面,通过减小填料粒径达到了提高柱效的目的。本文由四个部分组成。首先在第一章前言中,介绍了蛋白质组学的研究策略,以及在蛋白质组学分离中液相色谱固定相的最新发展情况,最后提出了本论文的研究内容。在第二章中,我们制备了粒径为3 μm的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相。首先在3 μm硅胶微球基质上键合乙烯基团,然后通过巯基-烯点击化学反应,将半胱氨酸键合到硅球表面,最后通过异氰酸十八酯与半胱氨酸上氨基的反应,将十八烷基链连接到硅球表面。这种填料的特点:一是具有两种色谱分离机制,其中,C18侧链表现为反相色谱分离机制,半胱氨酸上的羧基基团则表现为弱阳离子交换色谱分离机制;二是半胱氨酸上的羧基、羰基、氨基为亲水基团,且S原子等为极性分子,可以改善填料的疏水性质,在分离蛋白质酶切样品时起到减少肽段的不可逆吸附;三是合成填料的第一步反应——将乙烯基团键合到硅胶微球表面的反应,用到的试剂乙烯基三氯硅烷为小分子,反应过程中不存在空间位阻效应,因此硅胶微球表面的硅羟基可以充分反应而无需再进行封尾步骤。在这一章中,我们分别对磁力搅拌速度、反应试剂加入量以及含C18侧链化合物进行了选择和优化,最终确定最佳反应条件及试剂。采用扫描电子显微镜、红外分光光度法以及有机元素分析法对合成的填料进行表征,最终制备成球形颗粒完整、粒径均匀、含碳量达到14.9%的反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料。在第三章中,我们对制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的色谱性能进行了评价。首先通过其对苯同系物以及多环芳烃混合物的分离,证明其具有良好的反相分离作用;再通过与十八烷基反相固定相的分离结果对比,证明了我们制备的填料达到了预期的改善固定相疏水性的作用;最后通过在分离标准肽段的流动相中加入盐,使得肽段分离的柱效显著提高,证明了该固定相具有弱阳离子交换的分离机制。接着,将反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相用于标准肽段混合物的分离,可以将疏水性质相近而理论等电点不同的肽段有效分离。并且采用液压装柱法将制备好的填料装填至15 cm × 75 μm I.D.的直喷柱中,通过nanoLC-LTQ联用,在BSA酶切肽段的分离中获得了优良的分离和鉴定效果。最后,我们将这种混合模式色谱固定相用于Hep-G2细胞全蛋白酶切肽段二维分离鉴定的第一维分离中,得到了与商品化色谱柱相近的分离效果。在第四章中,我们将第一章中反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法,移植到粒径为1.7 μm球形硅胶基质上。由色谱速率理论知道减小固定相的粒径可以进一步提高柱效,因此,我们制备了一种亚二微米反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料。通过扫描电子显微镜、红外分光光度法以及有机元素分析法进行表征,最终制备成球形颗粒完整、粒径均匀、含碳量在达到14.5%的亚二微米反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料。接着对制备的亚二微米色谱填料进行色谱性能评价,表明其具有反相分离机制的同时,还具有弱阳离子交换的分离机制。进一步将其用于标准肽段混合物的分离中,获得了良好的分离度。同时由于亚二微米色谱固定相可以使用较短的柱长,因而缩短了分离时间,同时又不牺牲其分离效果,在蛋白组组学高通量大规模的分析中具有很强的应用潜力。