论文部分内容阅读
研究背景皮肤创伤修复是一个复杂的生物学过程,影响成体皮肤创伤愈合的因素包括细胞外基质、细胞因子、炎症细胞、修复细胞等。在修复过程中原位真皮细胞是主要的修复细胞,能够转化为肌成纤维细胞,造成大量细胞外基质沉积,并收缩创面,最终导致瘢痕形成。既往研究显示真皮细胞具有显著的异质性。谱系示踪发现真皮细胞中含有高纤维化潜能的细胞亚群,由于真皮细胞亚群间缺乏特异性的标志物,因此,探索鉴别人真皮细胞亚群的新技术对于研究真皮细胞各亚群标志物以及在创伤修复和纤维化过程中的作用具有非常重要的意义。本课题组研究发现七甲川花菁染料IR-780能够鉴别高纤维化潜能的真皮细胞亚群并依赖糖酵解表型,为皮肤纤维化的研究提供了潜在的技术手段。研究方法1.高摄取IR-780真皮细胞亚群(IR-780H)的分选与生物学特性的研究CCK-8用于检测体外IR-780对真皮细胞的毒性作用,选取安全浓度进行标记,鉴别出IR-780H真皮细胞亚群。采用流式分选的方法将其分离,通过近红外荧光显微镜观察荧光强度验证流式分选的准确性。通过形态学观察、CCK-8增殖能力检测法和集落形成能力等指标检测IR-780H真皮细胞亚群的形态、增殖能力和自我更新能力。进一步Real-time PCR检测IR-780H真皮细胞亚群的膜转运蛋白、糖酵解代谢相关酶基因的表达,并使用能量代谢检测仪检测其糖酵解活性。2.高摄取IR-780真皮细胞亚群纤维化相关特性的研究使用Real-time PCR、免疫荧光和Western blot法检测IR-780H真皮细胞亚群的细胞外基质及纤维化相关因子表达水平;通过Real-time PCR检测标记条件下的IR-780对细胞外基质及纤维化相关因子表达的影响;免疫荧光法检测IR-780H真皮细胞亚群α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,以及在转化生长因子β1(TGF-β1)刺激下转化为肌成纤维细胞的能力;观察体内创伤模型移植IR-780H真皮细胞亚群对创伤愈合的影响,进一步明确IR-780H真皮细胞亚群的纤维化潜能。研究结果1.高摄取IR-780真皮细胞亚群的分选与生物学特性的研究通过对IR-780作用于真皮细胞的毒性实验,筛选出安全标记浓度,成功建立流式分选IR-780H真皮细胞亚群的方法,同时近红外荧光显微镜下检测荧光强度证实了流式分选的准确性。形态学观察、CCK-8检测法和集落形成能力检测发现IR-780H真皮细胞亚群相较低摄取IR-780的真皮细胞亚群(IR-780C)具有更扁平的形态、较差的增殖能力和较低的自我更新能力。进一步发现IR-780H真皮细胞亚群细胞膜转运蛋白OATP1B3、糖酵解代谢相关酶PFK1、PFK2、LDH基因表达明显高于IR-780C;能量代谢检测发现IR-780H真皮细胞亚群糖酵解水平较高,证明IR-780能用于分离存在能量代谢差异的真皮细胞亚群。2.高摄取IR-780真皮细胞亚群纤维化相关特性的研究检测细胞外基质及纤维化相关因子水平,发现IR-780H真皮细胞亚群表达I型胶原、纤维连接蛋白和多功能蛋白聚糖细胞外基质及纤维化相关因子TGF-β1、CTGF的水平较IR-780C明显升高,并证实IR-780标记对真皮细胞中这些因子的表达无影响;通过检测肌成纤维细胞特异性的标志物(α-SMA)发现IR-780H真皮细胞亚群在TGF-β1刺激下向肌成纤维细胞转化的能力较IR-780C显著增强;动物实验结果显示,将IR-780H真皮细胞亚群移植到全层皮肤损伤大鼠模型后能明显促进创面收缩、增强创面局部的胶原沉积。研究结论1.首次揭示七甲川花菁染料IR-780可用于鉴别真皮细胞中具有高纤维化潜能的细胞亚群并依赖糖酵解代谢表型,探索建立了IR-780分选高纤维化潜能真皮细胞亚群的技术方法。2.通过检测细胞外基质、纤维化相关因子以及在TGF-β1刺激下向肌成纤维细胞转化的能力,初步证实IR-780H真皮细胞亚群的高纤维化潜能;通过创伤模型中瘢痕厚度与胶原沉积情况,体内证明IR-780H真皮细胞亚群的高纤维化潜能。