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目前,微藻因其具有重要价值的代谢产物而引来世界各国的高度关注,主要体现在其所含丰富的脂肪酸成份,同时,其丰富的次级代谢产物在人体健康营养方面具有重要的意义。 本研究主要是对分离自距我国山东省东营广饶县小码头44.08km的渤海沿岸地下海水两株微藻进行分子鉴定及其油脂分析;在基因工程水平,对金藻中具有生物活性和食品营养价值的萜类化合物的代谢调控开展初步研究。 1、利用18S rDNA和ITS主要分子指标,结合序列比对和系统发育树分析,对两株微藻进行分子鉴定、总脂提取以及脂肪酸各组分测定。研究主要结果如下: ①通过设计特定引物对两株微藻的18S rDNA和ITS片段进行扩增,获得序列经过NCBI软件比对,建立系统发育树分析,鉴定结果:D12 Strain为盐生微拟球藻(N.salina D12,登录号:JX185299);而另一株D2 Strain为寻常小球藻(C.vulgaris D2,登录号:JX185298)。 ②获得培养至平台期的N.salina D12和C.vulgaris D2油脂含量分别为44％和35%。 ③选择K(OH)-CH3OH作为皂化试剂提取脂肪酸,利用气相色谱法分析,结果显示:N.salina D12中,脂肪酸成分主要为C16:0,C16:1和C18:1,占总脂肪酸含量约80%,C20以上的长链多不饱和脂肪酸约15%,其中EPA约10%。C.vulgaris D2中,脂肪酸以C16:0,C18:1和C18:2为主,占总脂肪酸含量90%,不含C20以上的长链多不饱和脂肪酸。 2、ACAT是合成类异戊二烯天然物质(MVA途径)的第一个酶。本研究根据金藻(Isochrysis galbana CCMM5001)文库中ACAT的EST序列,克隆获得IgACAT(Isochrysis galbana ACAT)基因cDNA全长序列及对其生物信息学进行分析;应用RT-qPCR,以β-actin为内参基因,研究了IgACAT基因在不同浓度硝酸钠(mg/L)和不同温度(℃)条件下的表达差异。结果表明: ①以提取的金藻总RNA为模板,利用primer5.0软件设计特异性引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了IgACAT(GeneBank accession number:JQ310661),并对其进行了初步的生物信息学分析,IgACAT全长1,551bp,包括69bp的5′UTR和309bp的3′UTR;ORF长1,173bp,编码390个氨基酸,Mw为53.59kD,PI为9.04;进化树分析显示IgACAT与MVA途径中的ACAT聚为一类,而与β氧化途径中的KAT完全分开;同源性比对结果,与巴西橡胶树(Heve-bra,AAl18924),烟草(Nico-tab,AAU95618),玉米(Zea-may,ACG34735),鞘脂杆菌属(Mari-tra,YP_004053305),噬冷菌(Algo-sp,ZP_07721232),园杆菌(Bell-bal,YP_006408471),黄质菌属(Flav-sp,ZP_10483595),解肝磷脂土地杆菌(Pedo-hep,YP_003093161),加拿大鞘脂杆菌(Soli-can,YP_006255711),萝卜(Raph-sat,X78116)这些真核、原核生物体的ACAT基因的氨基酸序列高度同源,且有一非常保守的功能域(CNGGGGA)。 并推测此基因亚细胞定位于细胞质,具有两个跨膜区域(第46-64位和第365-386位)。 ②在氮过量(150mg/L Na3NO3)条件下,IgACAT基因在72h时表达量达到最高,为初始0h(对照)的约10.1倍;在氮正常(75mg/L Na3NO3)条件下,其在24h时表达水平达到最高,为对照的6倍,随着时间的延长,呈下降趋势;在氮缺乏(0mg/L Na3NO3)条件下,IgACAT基因表达水平在各个时间点都普遍偏低,且总体趋势无明显变化,与对照表达水平相当。 ③在高温下培养(35℃),IgACAT基因的表达量先急剧增加,在12h表达量达到最高,为0h(对照)的21倍,在12h以后,随着培养时间的延长,IgACAT基因的表达呈降低趋势,且均低于正常温度(25℃)培养时该基因的表达量;25℃时,其表达量自6h开始呈缓慢下降趋势;在低温条件(15℃)下培养时,IgACAT基因的表达在24h达到最高,但也低于高温和正常温度下此时的表达量,随着培养时间的延长,IgACAT基因的表达呈降低趋势。