恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。化疗是治疗恶性肿瘤的一个重要手段,然而,普通制剂的化疗方案存在化疗效率低下和毒副作用严重等问题。随着纳米技术在药物传递领域的广泛应用,这些问题有所改善。但是,目前应用于临床的纳米制剂还存在诸多不足,包括:载药量低(通常低于10%)、稳定性差、载体材料相关的毒副作用和储存过程中药物的结晶和泄漏等问题。因此,设计和构建新型的高效纳米药物传递系统仍然是亟待解决的难题。此外,前药策略也被广泛用于抗癌药物的传递。其中,紫杉醇-不饱和脂肪酸前药的研究取得了很大的进展。例如,紫杉醇-二十二碳六烯酸前药(PTX-DHA)已经进入了临床Ⅲ期研究。然而,最新的临床结果显示,与一线化疗药物相比,PTX-DHA前药的疗效并没有显著优势。在PTX-DHA前药结构中,紫杉醇和二十二碳六烯酸是通过酯键直接相连的,这可能会导致紫杉醇很难从强疏水的脂溶性前药上断裂下来,影响其抗肿瘤效果。与正常细胞相比,肿瘤细胞内的高氧化还原微环境已经被广泛用来设计氧化还原敏感的药物传递系统。针对PTX-DHA的临床效果不佳和传统纳米制剂的不足,本课题分别以单硫醚键、间隔双硫醚键和二硫键作为氧化还原敏感的化学连接臂设计了一系列紫杉醇-油酸前药,并构建了氧化还原敏感的紫杉醇-油酸小分子前药自组装纳米药物传递系统。在此基础上,比较了这些不同的氧化还原敏感的化学连接臂对前药纳米粒的体外释放、细胞毒性、药动学行为、体内分布以及抗肿瘤效果的影响。首先,以单硫醚键、间隔双硫醚键和二硫键作为氧化还原敏感的化学连接臂设计了三个氧化还原敏感的紫杉醇-油酸前药(PTX-S-OA、PTX-2S-OA和PTX-S-S-OA),并以酯键直接相连的非敏感紫杉醇-油酸前药(PTX-OA)作为对照。四个前药化合物均能在乙醇-水混合溶剂体系中自组装形成前药纳米粒(PTX-OA纳米粒、PTX-S-OA纳米粒、PTX-2S-OA纳米粒和PTX-S-S-OA纳米粒),前药纳米粒的粒径均在100nm左右。然而,由于这些前药纳米粒表面的疏水性很强,它们在盐溶液中的胶体稳定性较差,会因"盐析"作用而使得纳米结构被破坏,并析出沉淀。为了应对这一问题并延长前药纳米粒在血液中的循环时间,在前药纳米粒制备过程中加入15%的维生素E聚乙二醇2000琥珀酸酯(TPGS2k)作为PEG修饰剂,制备了PEG化的小分子前药自组装纳米粒(PTX-OA/TPGS2k 纳米粒、PTX-S-OA/TPGS2k 纳米粒、PTX-2S-OA/TPGS2k 纳米粒和 PTX-S-S-OA/TPGS2k纳米粒)。这些PEG修饰的前药纳米粒具有粒径均匀(100nm左右)、载药量高(>50%)和稳定性好等优点。以含过氧化氢(H2O2)或二硫苏糖醇(DTT)的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)-乙醇混合溶液(70/30,v/v)为释放介质,考察了PEG化的小分子前药自组装纳米粒在氧化条件或还原条件下释放紫杉醇的情况。PTX-OA前药具有很高的稳定性,无论在含氧化还原剂的释放介质还是在空白释放介质中,PTX-OA/TPGS2k纳米粒几乎不释放紫杉醇。相比之下,PTX-S-S-OA具有非常好的还原敏感特性,在含有10mMDTT的释放介质中,PTX-S-S-OA/TPGS2纳米粒在2 h内释放了超过90%的紫杉醇。PTX-S-OA和PTX-2S-OA都具有氧化还原双敏感特性,且PTX-S-OA较PTX-2S-OA具有更高的氧化还原双敏感响应能力。在含有H2O2或DTT的释放介质中,PTX-S-OA/TPGS2k纳米粒均比PTX-2S-OA/TPGS2k纳米粒能更快地释放紫杉醇。体外释放结果表明酯键相连的PTX-OA前药的释药速度非常慢,释药过于缓慢可能是导致临床中PTX-DHA前药药效不佳的原因。本课题设计的两个氧化还原双敏感的前药(PTX-S-OA和PTX-2S-OA)和一个还原敏感的前药(PTX-S-S-OA)能在氧化还原环境中选择性快速释放紫杉醇,有望实现在肿瘤细胞内氧化还原微环境中特异性快速释药,提高紫杉醇的抗肿瘤效果并降低对正常组织的毒副作用。采用MTT法考察了 PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒对人鳞状上皮细胞癌细胞(KB-3-1),人大细胞肺癌细胞(H460)和人卵巢癌细胞(OVCAR-8)的细胞毒性。由于前药存在释放母药的过程,因此,前药自组装纳米粒的体外细胞毒性均比Taxol低一些。不同前药自组装纳米粒的细胞毒性大小顺序为PTX-S-S-OA/TPGS2k纳米粒>PTX-S-OA/TPGS2k纳米粒>PTX-2S-OA/TPGS2k纳米粒>PTX-OA/TPGS2k纳米粒。值得注意的是,在设定的药物浓度范围内,PTX-OA/TPGS2k纳米粒没有表现出明显的细胞毒性。细胞毒性结果表明,前药纳米粒的细胞毒性大小与紫杉醇从前药中的释放难易程度相关,化学连接臂对肿瘤细胞内氧化还原环境的敏感性越高,紫杉醇就越容易从前药中被释放出来,其细胞毒性就越大。此外,我们还研究了KB-3-1细胞对香豆素-6标记的PEG化小分子前药自组装纳米粒的细胞摄取情况。香豆素-6溶液剂和香豆素-6标记的小分子前药自组装纳米粒的细胞摄取都具有时间依赖性。与香豆素-6溶液剂相比,香豆素-6标记的小分子前药自组装纳米粒在0.5 h和2 h均具有更高的细胞摄取。以Sprague-Dawley(SD)大鼠为模型动物,比较了Taxol、未修饰的小分子前药自组装纳米粒和PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体内药动学行为。与未修饰的前药纳米粒和Taxol相比,PEG修饰的前药纳米粒均能显著延长药物在血液中的循环时间。由于化学连接臂的氧化还原敏感性不同,PEG化的各前药纳米粒的药动学也存在一定差异。其中,由于PTX-OA前药酯键的高度稳定性,PTX-OA/TPGS2k纳米粒的AUC0-24h值(前药与母药加和)最大。不同PEG化的前药纳米粒的AUC0-24h值(前药与母药加和)的大小顺序为:PTX-OA/TPGS2k纳米粒>PTX-2S-OA/TPGS2k纳米粒>PTX-S-S-OA/TPGS2k纳米粒>PTX-S-OA/TPGS2k纳米粒。此外,我们以人鳞状上皮细胞癌(KB-3-1)荷瘤裸鼠为研究对象,考察了DiR标记的PEG化小分子前药自组装纳米粒的组织分布情况。DiR溶液剂的荧光主要分布在肺部,在肿瘤组织中的荧光十分微弱。与DiR溶液剂相比,DiR标记的PEG化小分子前药自组装纳米粒在肿瘤组织的荧光强度显著增加。体内分布结果表明,前药纳米粒能显著增加药物在肿瘤部位的积蓄,减少药物在非肿瘤部位的分布。以人鳞状上皮细胞癌(KB-3-1)荷瘤裸鼠为动物模型,考察了 Taxol和PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体内抗肿瘤效果。PBS和PTX-OA/TPGS2k纳米粒不能有效抑制肿瘤细胞的生长,荷瘤裸鼠的肿瘤体积生长迅速。相比之下,PTX-2S-OA/TPGS2k纳米粒和Taxol能在一定程度上延缓肿瘤的生长,但二者之间的抗肿瘤效果并没有统计学差异。更重要的是,PTX-S-OA/TPGS2k纳米粒和PTX-S-S-OA/TPGS2k纳米粒组展现出很强的抑制肿瘤细胞生长的能力。给药结束后,PTX-S-OA/TPGS2k纳米粒给药组中荷瘤裸鼠的肿瘤体积几乎没有增长。更令人惊喜的是,在PTX-S-S-OA/TPGS2k纳米粒组中荷瘤裸鼠的肿瘤几乎消失不见了。体内抗肿瘤效果与体外释放结果和细胞毒性结果相一致,表明化学连接臂对肿瘤细胞内氧化还原条件的敏感性越高,越容易实现紫杉醇在肿瘤细胞内的特异性快速释放,相应的前药纳米粒的抗肿瘤效果就越好。此外,在整个给药过程中,对照组和给药组的荷瘤裸鼠的体重都没有减轻,也没有发现明显的肝肾毒性。体内药效结果表明PTX-S-OA/TPGS2k纳米粒和PTX-S-S-OA/TPGS2k纳米粒在具有明显的抗肿瘤效果的同时,没有对机体造成显著的非特异性毒性,是安全有效的抗癌药物传递系统。