背景毛囊是控制毛发生长的皮肤附属器官,在哺乳动物的整个生命过程中,毛囊反复经历着生长期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)的过程,通过循环周期性的生长,毛囊显示出了充分的自我再造能力。另外人们发现不同物种的毛囊其生长周期的长短不同,其节律也不尽相同。例如,人和豚鼠其不同部位的毛囊生长周期的节律不同。而大多数脊椎动物的生长节律则是同步的。那么这个控制生长周期节律的生物钟在什么部位?受哪些因素的调节?这些问题目前尚待阐明。一直以来毛囊生长周期的研究热点是关于各种生长因子或细胞因子。很多学者对比研究这三个不同周期,比如环境因素的刺激、细胞因子表达的差异和细胞凋亡情况等,然后提出其可能的调控作用,这所有的理论研究都还待进一步证实。目前已经确定的关于参与毛囊生长周期调控的可溶性因子,如毛囊生长期表达的重要生长因子胰岛素样生长因子；毛囊生长期向退行期转变过程中的转化生长因子；毛囊休止期向生长期转化过程中的骨形成蛋白等。但这些因子的作用机制有的还不是非常清楚。另外,关于毳毛向硬毛的转化机制、部分毛囊退出毛囊生长周期、巨噬细胞和肥大细胞在生长周期中的作用、中枢神经系统对毛囊生长周期的调控和毛囊对皮肤生物学的影响等方面,有关学者也进行了大量的研究并得到了一定的进展。毛囊的生长和发生是非常复杂的多因素相互调控和相互影响的过程,毛囊的发育成熟,需要间质细胞与上皮间的基质成分产生一系列的信号传递,来促进细胞之间的相互作用才能完成。在毛囊周期循环的过程中,一些细胞因子、活性蛋白、酶类、激素等均可对毛囊周期的生长产生促进或抑制作用,而这些物质均存在于细胞外基质中。各种细胞依赖于细胞外基质才能构筑基本结构。所以ECM中含有的各种成分对细胞的生长和增殖都有着非常关键的作用。基质金属蛋白酶(Matrix metallproteinases,MMps)是一类由许多结构和功能相近似的中性蛋白酶所组成的多基因、内源性的Zn依赖性酶家族。它是由单核细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等多种细胞产生,可以降解除了多糖以外的所有细胞外基质成分。基质金属蛋白酶的降解功能可以导致相关细胞外基质出现重塑,尤其是能够分隔毛囊的上皮层(如外根鞘等)和间质层(如真皮鞘和真皮乳头等)的基底膜,这对于正常毛囊的生长和发育是必要条件。基底膜的重塑,对于毛囊生长周期内上皮与间质成分间的信号传输以及生长期下段时毛囊延伸并侵犯皮下组织是必不可少的。基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inbitors metalloproteinases,TIMPs)是MMps的内源性特异性抑制物。TIMPs家族里共有四个成员,分别为TIMP-1、TIMP-2、 TIMP-3和TIMP-4。在正常的生理过程中,比如生长发育、组织修复等,均涉及到对ECM的降解和准确定位,这就是ECM的重塑过程。在此过程中,可能会引起疾病,如癌症、关节炎和心血管疾病,虽然是一种修复性的行为,但往往是特异且破坏性的表达。目前已知的各种类型的蛋白水解酶中,最主要的酶系就是基质金属蛋白酶家族(MMPs)。研究表明,MMPs在调节细胞表面的生物活性分子方面和调节细胞环境方面都有重要作用,并最终影响到细胞的行为方式。有着特定功能的酶在正常或病理状态下也会有不同的功能表现,在明确MMP的作用方面,抑制剂是目前主要的研究方向。本研究通过对MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2在毛发周期过程中动态变化的规律及作用机制进行深入探索。研究中以3周到12周的C57BL/6雌鼠的毛发生长周期为标准,通过系统性地检测并结合动物实验,来分析基质金属蛋白酶及其抑制剂对毛发周期的作用规律和影响,并初步探索了其中的作用机制,为理解细胞外基质消解变化的原因及其对毛发周期的作用提供了新的研究策略。该研究结果对阐明毛囊生长周期调控机制、研究毛囊生物学、毛发形成及重建并最终发展有效治疗脱发的手段具有重要意义。目的1.探寻毛发周期内MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2的动态变化规律2.寻找基质金属蛋白酶抑制剂SB-3CT对毛发生长的影响3.探索抑制剂影响毛发生长过程中可能的机制方法1.毛发周期中MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2动态分析1.1明胶酶谱取3周到12周C57BL/6雌性小鼠各个周期50mmg小鼠皮肤组织,加500ul的裂解液进行研磨组织,制备10%匀浆溶液,14000rpm 4℃离心10min,取上清。取100ul与25ul 5×上样缓冲液混合。配制分离胶和浓缩胶,5u1/孔上样(根据表达强度和蛋白浓度确定上样量),4℃进行SDS-PAGE电泳100v约1.5小时(电泳时在周围敷上冰,有利于使条带跑直)。电泳结束后,将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液中37℃孵育42h。孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic亮蓝、30%甲醇、10%乙酸)染色3h,及脱色液3h,显示出MMP-2(72KD)和MMP-9(92KD)为位于蓝色背景上的透亮带。1.2免疫组化1.2.1常规HE：取各个周期的组织标本用福尔马林固定液固定6h以上后脱水包埋,再进行常规组织切片、烤片,最后进行染色和中性树胶封片。1.2.2免疫组化：将石蜡切片进行烤片、脱蜡至水后,再用蒸馏水洗3min,柠檬酸盐缓冲液高压修复3 min,自然冷却至室温,接着用3% H2O2抑制内源性过氧化物酶室温下孵育10min, PBS液冲洗后,分别将Anti-TIMP1、Anti-TIMP2、 Anti-MMP、Anti-MMP2用抗体稀释液以1：200稀释后,滴加抗体于组织切片上,最后滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体37℃孵育30 min,滴加DAB显色液后,苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。1.2.3 ELISA:将试剂盒以及样品平衡至室温(18-25℃),再将所有标准品以及样品使用单孔检测,在已经包被抗体的ELISA板对应的孔内加入100 μL配制好的标准品及样品,用封板膜封住整块板条,4℃孵育过夜；将配制好的1x洗液添加到洗板机上,用洗板机清洗板条4次,每孔加入300μL洗液,每孔加入100μL配制好的检测抗体(生物素标记抗体),室温孵育1h,清洗后每孔加入100μL配制好的HRP-链霉亲和素室温孵育45 min,再次清洗后加入100μL TMB显色液至每孔中,室温避光孵育30min,最后加入50μL终止液至每孔中,立即在酶标仪450 nm读数。1.2.4 qRT-PCR:用液氮研磨组织至粉末后进行总RNA抽提、去基因组后,进行总RNA纯度和完整性检测,证明总RNA抽提比较完整后再进行逆转录。在进行定量PCR检测前先进行引物测试,确定好上机内容后编排好上机的样品排放顺序,然后进行正式实验,将实验中计算好的体系按具体量配置,总的体系配好后装至八连管中,最后使用定量PCR仪,每个样重复3次,得到最后的结果。2.动物实验首先将8周的C57BL/6雌性小鼠背部的毛发剪短,然后用棉球蘸取脱毛膏,在所需部位(约8cm2)脱毛,将脱毛后的小鼠背部分别涂用不同浓度的SB-3CT基质金属蛋白酶抑制剂,一天2次,一个星期5天,共30天。实验周期的30天内,拍摄老鼠背部照片,一天一次。通过观察图像评估小鼠毛发再生,计算毛发再生比率。定期安乐死小鼠后再切取每只小鼠的背部皮肤,对小鼠皮肤进行HE染色,通过Image J软件进行图像分析,计算不同时期毛囊数量及毛囊长度,同时进行相关免疫组化、ELISA及HE染色,最后将所得到的数据、图片资料汇总整理。3.研究VEGF-IGF-1-TGF-β信号通路在毛发再生中的作用及与MMP的关系3.1定量PCR检测3.1.1皮肤组织总RNA的提取先在研钵中加入液氮,再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末,用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有lml的Trizol液的EP管中(注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%),充分混合均匀。室温放置5min,然后加入200u1的氯仿,盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。12000rpm离心10min,取上层水相于一新的EP管中(千万不要将中间的沉淀层和下层液混入,否则重新离心分离),加入500u1异丙醇,温和颠倒混匀。室温放置10min,12000rpm离心10min。小心地弃去上清液,加入1ml的75%乙醇,涡旋混匀,4℃下12000rpm离心5min。重复操作一次。弃去上清液(尽量将残余液体除去),室温或真空干燥5～10min(注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度)。用30ulDEPC处理过的水将RNA溶解,必要时可55℃-60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。3.1.2 RNA样品逆转录及PCR反应以1μg总RNA为模板,进行逆转录,37℃,60min; 98℃,10min,合成cDNA第一链。已cDNA链为模板进行PCR实验。3.2:ELISA3.2.1总蛋白的提取取40 mg固体组织剪碎后加入0.5ml裂解液(提前按比例加入PMSF, cocktail,磷酸酶抑制剂等),放入玻璃匀浆器内上下手动匀浆破碎组织。待样品尽量全部磨碎后,将蛋白溶液转移至1.5 ml EP管中。冰上充分裂解30 min。4℃离心机14000 rpm离心10 min后取上清即为总蛋白溶液。3.2.2 ELISA检测分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100ul,轻轻晃动混匀,覆上板贴,37℃温育1.5小时。弃去液体,洗涤5次。每孔加生物素化抗体工作液100u1,覆上新的板贴,37℃温育1小时。弃去孔内液体,洗板5次,甩干。每孔加酶结合物工作液100u1,覆上新的板贴,37℃温育30分钟。弃去孔内液体,洗板5次,甩干。每孔加入显色底物溶液(TMB) 100ul,37℃避光显色15分钟。每孔加终止溶液100u1,终止反应。在反应终止后5分钟之内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。4.统计学分析应用SPSS 17.0软件进行统计分析,所得数据用均数±标准差表示(x±S)。多组计量资料采用方差分析比较,方差齐采用One-Way ANOVA,两两比较用LSD分析,方差不齐则应用welch,两两比较用Dunnett’s T3分析,同一时间点两组的比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.在3周到12周的C57BL/6雌性小鼠的背部毛发周期中,MMP-2、MMP-9的酶活性在每个周期都存在。对于MMP-2、MMP-9,酶活性在毛发周期内始终处于波动状态。在毛发周期的第1个生长期内,MMP-2的酶活性出现先下降后上升的趋势,并且达到了酶活性的最低值；而第2个较长的静止期内,酶活性出现先上升后下降的状态,并且达到了酶活性的最高值。而且,在第一个生长期过渡到退行期时,MMP-2、MMP-9的酶活性逐渐上升,退行期过渡到静止期时,MMP-2、MMP-9的酶活性逐渐下降,静止期过渡到生长期时则快速下降。对照MMP-9的酶活性曲线,我们得出了类似的结论。并且通过HE染色我们获得了典型的组织图像。MMP-2, MMP-9的酶活性表达的波动,与qRT-PCR和ELISA测定的mRNA和蛋白波动水平相类似。证明了基质金属蛋白酶MMP-2, MMP-9的mRNA和蛋白表达在毛发周期中是相似的和可检测的。他们的水平在5和7周时处于最低值,在毛发周期第10周处于最高值。下一步我们检测是否TIMP-1和TIMP-2的表达是不同于他们对应的激活剂MMP-9, MMP-2。最终我们发现,TIMPs的mRNA和蛋白水平波动状态在对应的第5、7周时处于最高值,第10周处于最低值。毛发周期内波动变化的趋势与MMPs相反。所有这些表明了,TIMPs与MMPs是互为激动剂与抑制剂的关系。在毛发周期的每个阶段,为了确定MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2的表达部位,我们通过免疫组化的图像来显示。对于MMP-2、MMP-9、TIMP-1在毛囊处表达为阴性或弱阳性,TIMP-2在毛囊处表达为强阳性。在皮肤层中,皮脂腺、皮下组织层均可见MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2有表达。2.动物实验中,SB-3CT这种高效选择性明胶酶抑制剂作用于剃毛后小鼠背部皮肤后,与空白对照组相比较,实验组的小鼠毛发生长速度整体较慢,单位面积毛发的长度和数量整体也较空白组低。通过HE染色的典型图像也证明了这一点。免疫组化染色显示MMP-2、MMP-9在毛囊部位表达为阴性或弱阳性,再次证明了前面实验的结果。3.将剃毛后的小鼠背部皮肤取材,将SB-3C实验组和空白组分别进行VEGF、IGF-1、TGF-β的mRNA和蛋白水平检测发现,在毛发周期内生长期、退行期和静止期各个阶段,VEGF、IGF-1的实验组值较空白对照组明显下降,而TGF-β的实验组值较空白对照组逐渐上升。结论1.本研究通过MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2在小鼠毛发周期的动态变化规律,说明由于由于生长期需要大量的基质金属蛋白酶来消化细胞外基质以释放其中的关键细胞因子或激素,所以需要较长时间的静止期才能积累足够量的基质金属蛋白酶,并在生长期的早期出现明显的下降,故基质金属蛋白酶对毛囊器官的周期性生长可能起到关键作用。提示我们MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2参与毛乳头细胞外基质的重塑,并且这种重塑又与毛囊生长周期密切相关。免疫组化的结果说明基质金属蛋白酶在毛囊器官或周围的附属器官都存在,并不是只表达在单一的组织器官内。2.基质金属蛋白酶抑制剂对毛发生长有抑制作用,从另一方面也证实毛发周期性生长与MMP-2, MMP-9有关,并且可能通过影响VEGF、IGF-1、TGF-β的通路来影响的毛发生长。