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目的马兜铃酸肾病(Arisolochic acid nephrapathy，AAN)是由于服用含有马兜铃酸(Arisolochic acid，AA)的中草药所致的急慢性间质肾病。临床上表现为急性肾衰，慢性肾衰和(或)肾小管酸中毒。肾脏病理主要表现为肾小管上皮细胞坏死、脱落、小管基底膜萎缩，间质大量单个核粒细胞浸润和(或)纤维化及微血管病变，血管壁增厚、管腔狭窄、甚至完全闭塞。近年来AAN受到国内外广泛关注，但目前对AAN的治疗尚无成熟方法。本实验目的是通过关木通水煎剂灌胃制备慢性马兜铃酸肾病(Chronic arisolochic acid nephrapathy，CAAN)大鼠模型，观察应用羟苯磺酸钙(安多明)治疗对CAAN大鼠24小时尿蛋白定量，血肌酐(Scr)，血尿素氮(BUN)以及肾小管周毛细血管(PTC)内皮细胞特异抗原CD34和血管性假血友病因子(von Willebrand factor，vWF)表达的影响。探讨羟苯磺酸钙改善CAAN大鼠模型肾脏微循环障碍的作用和机理。材料和方法一．实验材料1．实验动物雌性Wistar大鼠60只，周龄7～8周，体重190～220g。随机分为3组，每组20只。分为正常对照组，CAAN未治疗组，羟苯磺酸钙治疗组。2．主要试剂和药品中药关木通、羟苯磺酸钙(安多明)、Masson试剂盒、兔抗大鼠CD34多克隆抗体免疫组化试剂盒、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒、兔抗大鼠vWF多克隆抗体免疫组化试剂盒、生物素化羊抗兔IgG。3．主要仪器光学显微镜，显微照像仪，显微图象分析仪，分光光度计，离心机，全自动生化分析仪。二．实验方法1．关木通水煎剂配制方法取关木通生药材2000g，加6倍饮用水，浸泡30分钟，加热至沸，煎煮30分钟，倾出药液，残渣再加入4倍饮用水，煎煮30分钟，合并两次药液，过滤，浓缩后制成1000ml水煎剂(相当于2g生药/ml)，4℃放置备用。2．实验动物分组及给药方法将Wistar大鼠随机分3组，每组20只均经口灌胃。(1)对照组：饮用水灌胃16周，剂量10 ml/(kg．d)，分两次灌胃。(2)未治疗组：关木通水煎剂灌胃12周，剂量20g/(kg．d)相当于10ml/(kg．d)，再予饮用水灌胃4周，剂量10ml/(kg．d)，分两次灌胃。(3)治疗组：关木通水煎剂灌胃12周剂量、方法同未治疗组，再予羟苯磺酸钙灌胃4周，剂量100mg/(kg．d)(100mg溶于10ml饮用水)，分两次灌胃。实验期间大鼠均自由饮食，饮水。3．尿蛋白及肾功检测在第12周，16周分别将大鼠放入代谢笼中收集24小时尿液，记24小时尿量，采用磺柳酸—硫酸钠比浊法测尿蛋白。收集尿液后用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，剖开腹腔，下腔静脉采血，测血尿素氮(BUN)，血肌酐(SCr)。取肾组织，置于4％多聚甲醛备用。4．肾组织形态学检查肾组织标本用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE和Masson常规染色，普通光镜观察。5．免疫组织化学结果分析按ABC法进行免疫组织化学染色，DAB显色。用显微照像仪照像，用显微图象分析仪对图像进行定量分析。每张切片随机选取5个高倍视野(400倍)，测定其阳性染色物质积分光密度(Intergrated optical density，IOD)值。6．统计学方法计量数据用均数±标准差表示，两组间均数比较，应用t检验，组间差异比较采用t检验，用统计软件SPSS13.0分析处理。结果1．尿蛋白及肾功检测关木通水煎剂灌胃12周，未治疗组和治疗组大鼠24小时尿蛋白定量，血清尿素氮，血肌酐升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。第16周，未治疗组24小时尿蛋白定量为(63.56±12.7)mg/24h，BUN为(17.38±2.72)mmol/L，Scr为(83.5±9.91)umol/L；治疗组24小时尿蛋白定量减少为(35.58±3.88)mg/24h，BUN下降为(13.8±2.38)mmol/L，Scr下降为(66.75±8.45)umol/L，与未治疗组比较差异有统计学意义(P<0.01)。2．病理检测第16周Masson染色，未治疗组间质纤维化区域积分光密度值为(69.97±17.69)×10~3，治疗组大鼠肾间质纤维化减轻，间质纤维化区域积分光密度值为(38.22±5.17)×10~3，与未治疗组比较差异有统计学意义(P<0.01)。3．免疫组织化学结果3．1 CD34结果：第16周，与未治疗组比较，治疗组大鼠CD34阳性表达增加，未治疗组CD34~+-IOD值为(3.19±1.4)×10~3，治疗组CD34~+-IOD值为(16.7±4.2)×10~3。两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。3．2 vWF结果：第16周，与未治疗组比较，治疗组大鼠vWF阳性表达减少，未治疗组vWF~+-IOD值为(18.66±4.65)×10~3，治疗组vWF~+-IOD值为(10.16±1.68)×10~3。两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论1．羟苯磺酸钙治疗能减少CAAN大鼠尿蛋白的排泄，改善肾功能。2．羟苯磺酸钙治疗能减轻CAAN大鼠肾间质纤维化。3．羟苯磺酸钙治疗能增加CAAN大鼠肾组织CD34~+细胞的表达，增加肾小管周围毛细血管密度；羟苯磺酸钙能减少CAAN大鼠肾组织vWF~+细胞的表达，减少微血栓形成。