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随着工业化与信息化的发展,对开发利用磷脂酶A1的研究不断深入将对食品领域与生化医药工业产生重大影响。粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因pla A1下游有一段命名为pla S编码辅助蛋白的基因,该蛋白虽然在大肠杆菌异源表达过程中不显示酶活力,却对宿主菌的生长状况呈现出显著的抑制作用,且对这种抑制作用鲜有报道。因此为了进一步研究磷脂酶A1辅助蛋白Pla S对宿主菌的抑制现象与机理,本论文在传统生物信息学分析方法的基础上,采用融合荧光报告基因示踪法探索了辅助蛋白的亚细胞定位信息,通过荧光分光光度法和气相色谱-质谱联用仪等方法探究了宿主菌诱导表达辅助蛋白Pla S后对细胞膜特性与组成的影响,最终通过转录组学测序与分析,从分子水平研究PlaS对宿主菌的抑制机理,为进一步阐述该机理及其功能开发提供支持。主要研究内容与结果如下:（1）使用融合增强型绿色荧光报告基因定位法构建了绿色荧光基因egfp与辅助蛋白基因pla S融合表达的重组菌株,探索试验得到较好的培养与诱导条件,并使用激光共聚焦显微镜快速捕捉荧光画面。最终验证了生物信息学对Pla S的亚细胞定位信息预测,证明了Pla S是定位于大肠杆菌的细胞膜上,属于膜蛋白。这将为后续细胞膜特性与组分的变化探究试验指明了方向。（2）生长曲线显示,与对照菌株P28相比,表达PlaS的SP28菌株在诱导8 h时细菌开始明显表现生长抑制现象。在细胞膜特性的方面,流式细胞术实验确定了大肠杆菌在诱导表达Pla S蛋白8 h后通透性出现明显增大。荧光分光光度计检测出大肠杆菌细胞外膜通透性会在诱导表达8 h后显著提高,而在12 h时外膜已经破裂消失。内膜的通透性会在诱导12 h后明显提高。实验结果与流式细胞仪结果一致,这表明Pla S对细胞膜通透性有显著增强作用。在大肠杆菌细胞膜流动性实验中,诱导8 h后细胞膜流动性出现明显增高,诱导12 h后细胞膜流动性参数已经高出对照组两倍,可以认为此时细胞膜已经破碎。细胞的表面疏水性实验也表明了大肠杆菌在表达PlaS蛋白表达12 h时严重下降,表明此时细胞表面已经失去黏附能力,代谢活力不强甚至已经衰亡。而截除N端27个氨基酸的d SP28菌与对照菌株各项特性无明显差异,可认为是解除抑制,与生长曲线表现相同。（3）通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测大肠杆菌在表达Pla S后不同诱导时间下的细胞膜脂肪酸含量及种类,得到各个样品内脂肪酸的绝对峰面积。结果表明:表现出生长抑制作用的SP28中顺式单不饱和脂肪酸（CMUFAs）的相对含量在诱导8 h后为20.19%,比诱导4 h后低8.38%,而同期对照P28中CMUFAs的相对含量比SP28高10.1%。相反,8 h时直链饱和脂肪酸（LSFAs）和反式单不饱和脂肪酸（TMUFAs）的相对含量分别增加了9.62%和3.83%。反式单不饱和脂肪酸与直链饱和脂肪酸相对含量的降低,以及顺式单不饱和脂肪酸相对含量的增加,导致膜刚性增强,流动性减少,细胞膜组分与结构表现异常导致细胞易死亡。相较于对照菌株P28,解除抑制的菌株dSP28脂肪酸种类与含量并无显著变化。（4）通过SDS-凝胶电泳实验表明,相较于对照菌P28与截短工程菌d SP28,SP28菌株在诱导培养4 h后开始有部分条带明显显示,说明在Pla S作用下,细胞膜蛋白逐渐从膜上脱落,易于用有机相萃取出来,而在8 h后条带却不明显,可以指示出此时细胞膜已经破裂甚至裂解,在细胞破裂的相关条件下膜蛋白已经严重降解,难以通过SDS-凝胶电泳提取出膜蛋白以检验出膜蛋白种类的具体变化。可得出结论磷脂酶辅助蛋白Pla S对细胞膜膜蛋白的含量与种类有所影响,从而使得宿主菌表面疏水性变化,对其起到抑制生长的作用。（5）通过分析大肠杆菌在诱导表达PlaS的转录组学信息,结果表明,质粒空载菌株P28表达了3548个基因,表达辅助蛋白Pla S全长基因的工程菌株SP28表达了3817个基因,表达Pla S截短N端前27AA氨基酸的工程菌株d SP28表达了3633个基因。d SP28和SP28共同调控的基因为3545个,d SP28和SP28特异调控的基因分别为78、166个。与P28相比,d SP28和SP28表达差异显著的基因分别有69个和52个,其中表达不同的基因有13个重叠。通过KEGG数据库和GO数据库的注释分析表明,乙醇酸脱氢酶活性、肠杆菌素合成酶复合体、苹果酸合酶活性、细胞质翻译的调节、从头翻译后蛋白质折叠、分子伴侣辅因子依赖的蛋白质重折叠以及膜运输、碳水化合物代谢、蛋白质折叠以及老化等方面的途径具有明显差异。因此,直接鉴定出了周质丝氨酸内蛋白酶Deg P、K+转运P型ATPase亚单位Kdp B、半乳糖-1-差向异构酶、外膜脂蛋白Yhb C、L、D-转肽酶Ldt C、核糖ABC转运蛋白周质结合蛋白6个基因。（6）通过qPCR验证了以上基因的表达水平上下调的正确性,并总结了相关基因的作用流程。首先gal M基因下调,导致细胞糖代谢速率减弱,ATP供应能力下降,这将直接影响细胞生长缓慢,并导致后续基因表达能力下调。然后,rbs B下调使细胞膜蛋白合成速率降低,细胞膜易受损并难以修复。同时,非正常蛋白质的合成增多,使deg P表达量被迫上升,以降解异常蛋白。而Deg P的增多也会错误攻击膜脂,从而导致细胞膜进一步出现破损。同时,kdp B也呈现下调表现,表明细胞膜选择透过性出现异常,进一步加剧细胞膜失常、破裂。这致使ltd C基因上调以维持细胞外膜与布朗脂蛋白的结合,支撑细胞膜的完整,但此过程又需要耗费大量ATP,从而陷入恶性循环,导致细胞膜最终破裂,细胞死亡。