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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),又称老年痴呆症,是目前影响老年患者生活质量的重要疾病,乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChE)是预防及治疗该病的有效药剂。石杉碱甲(huperzine A, Hup A)是一种分离自我国药用植物蛇足石杉的天然生物碱,具有高效、特异、可逆的乙酰胆碱酯酶抑制活性,用于治疗AD,毒副作用小,持续周期长,不易产生耐受性。Hup A药品来源目前有两个途径：天然植物提取和人工合成。前者受蛇足石杉野生资源的特殊生境限制和过渡采挖,天然贮量已经越来越少,人工栽培尚未成功。后者则因合成步骤繁琐、成本高、活性低,应用受限。据报道,蛇足石杉有极为丰富的内生菌资源,内生菌长期处蛇足石杉植株体内的特殊生境,协同进化,使其也具有了产Hup A的能力,目前有报道已发现蛇足石杉内生菌具有一定的产Hup A能力,因此,利用产石杉碱甲的蛇足石杉内生菌生产Hup A,使其成为Hup A的新型药源,已引起世界医学尤其是中医药领域的极大关注。本论文对蛇足石杉丰富的内生真菌进行分离,筛选产石杉碱甲的蛇足石杉内生菌,为真菌来源的石杉碱甲药品开发做基础理论研究。取蛇足石杉相关组织表面进行彻底的消毒灭菌处理后,于人工培养基培养,对从植株组织内部生长出来的内生菌分离、纯化,再经过扩大发酵后,收集菌丝体,采用酸水法,运用高速逆流色谱仪(HSCCC)对其所含生物碱进行制备性提取,以标准品Hup A作对照,使用高效液相(HPLC)检测菌株的生物碱,对总生物碱提取物用薄板层析(TLC),液质联用色谱(LC-MS)等分析手段进行分析检测,从分子极性、分子量、官能团等多角度鉴定其化合物；对确定产Hup A的蛇足石杉内生菌ES026A进行形态学和分子生物学鉴定,确定其分类地位。具体结果如下：1从蛇足石杉不同组织分离获得64株内生真菌。以采自湖北恩施佛宝山的野生蛇足石杉为材料,分别取不同组织部位,经彻底地表面消毒,采用微生物常规分离纯化方法,获得了64株内生真菌。叶片和茎部的分别占41%和53%,其它占5%。记录整理其形态学特征、分类编号保藏于-70℃冰箱。2筛选到1株产Hup A的蛇足石杉内生真菌ES026A。取分离获得的48株蛇足石杉内生真菌扩大发酵,收集菌丝体,采用酸水法,以高速逆流色谱仪(HSCCC)提取制备生物碱,运用高效液相进行Hup A的定性定量检测,与标准品Hup A的色谱图比较发现,与标准品Hup A具有相同的特征峰保留时间,经LC-MS检测证明,含有与标准品Hup A相同的一级、二级色谱图物质。经TLC检测,同一条件下与标准品Hup A具有相同的迁移率。3基本明确了蛇足石杉内生真菌ES026A的Hup A产率和其生物活性。经测,ES026A的Hup A产率,按干菌丝测算达1μg/g, ES026A粗生物碱对AChE的IC50为0.23313μg/mL。较标准品Hup A的IC50高约3倍。4 ES026A为胶胞炭疽属胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)结合ES026A菌株的产孢方式、菌丝形态显微观察,菌株DNA的ITS序列扩增、测序、NCBI比对,ES026A为胶胞炭疽属胶孢炭疽菌。该序列提交到GENEBANK并获得序列号HQ876466.1。经查已有报道,本菌株为首次发现具产Hup A的能力。5发现1株产Hup A同系物的蛇足石杉内生真菌ES052BA蛇足石杉内生菌ES052BA的生物碱经LC-MS检测显示,与标准品Hup A一级质谱图不同,但具有相同的二级质谱,说明该生物碱与标准品Hup A具有相同的母核,推知应属Hup A的同系物或衍生物。