研究目的及意义：自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程,是真核细胞特有的生命现象。泛素-蛋白酶体系统主要降解短半衰期蛋白质,相对于其而言,细胞的自噬被认为是大多数长半衰期蛋白质和细胞器通过溶酶体降解和再循环一种途径,对细胞内环境的稳态和细胞生存至关重要。在应激条件如饥饿、低氧、大脑局部缺血下,可诱导自噬的表达增加,提示自噬可能是一种细胞自身的重要生存机制。近十年,随着酵母模型的成功建立和基因技术的发展,研究者发现了4组酵母自噬相关基因atg (Autophagy-related gene, ATG),它们的编码蛋白在自噬的诱导、发生、成熟、再循环中起着重要作用。其中Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class Ⅲ PI3K)复合物(Atg6-Atg14-Vps15-ClassⅢ PI3K)磷酸化磷脂酰肌醇(PI)为3-磷脂酰肌醇(P13P),募集胞浆中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白质,用于自噬体膜的形成。已发现自噬的分子机制在高等真核生物中与酵母类似,具有保守性。目前已经在酵母中发现30个不同自噬相关基因(ATG),其中大部分在哺乳动物中具有同源性,对这些基因产物进行分析,有利于发现自噬的机制及其作用。Beclin1是酵母自噬基因6(Apg6/Vps30)在哺乳动物的同源物,和抗凋亡基因Bcl-2相互作用,可能参与自噬与凋亡的启动机制,对细胞生存和死亡有重要意义。自噬的信号调控机制主要有：(1)依赖nTOR (marmmalian targetof rapamycin)通路；(2)P13K通路；(3)其他蛋白通路。泛素蛋白酶体系途径和自噬溶酶体途径是细胞内蛋白质降解的两条主要途径。蛋白酶体抑制剂乳胞素能够导致C57BL/6型鼠PC12细胞泛素蛋白酶体功能障碍,雷帕霉素能够减少乳胞素诱导的PC12细胞凋亡和泛素化蛋白聚集,显著减轻黑质多巴胺神经细胞丢失和纹状体多巴胺神经细胞减少,而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤能够阻断这种保护作用。另外,雷帕霉素能够升高Bcl-2的水平并且阻断细胞色素c从线粒体释放到细胞质。神经退行性疾病的相同点是异常蛋白在细胞内蓄积,例如与亨廷顿病(Huntington’s disease, HD)发病相关的亨廷顿蛋白(Huntington, Htt)、帕金森病发病相关的a-突触核蛋白等,而这些蛋白主要是依赖自噬途径被降解。对亨廷顿病的研究发现雷帕霉素能够提高亨廷顿蛋白的清除能力,减少亨廷顿蛋白的蓄积及其毒性。在果蝇的亨廷顿病模型中雷帕霉素能够阻止神经的退行性变；在转基因亨廷顿病小鼠模型中雷帕霉素的同源物细胞周期抑制剂-779能够改善与HD相关的行为表现并能够降低异常蛋白聚集物。这些已经在细胞模型、斑马鱼和老鼠模型中得到了证明。Wang等的研究表明线粒体自噬(mitophagy)对神经细胞的生存具有保护作用,褪黑素可能通过诱导自噬来清除受损的线粒体,这可能是褪黑素抗缺血再灌注损伤的机制之一。自噬维持心脏正常功能发挥重要作用。在缺乏ATG5小鼠,出生后死于心脏高水平的自由氨基酸ATG和能量消耗。成年小鼠在心脏诱导敲除ATG5引起心肌肥大,左心室扩张和收缩功能障碍,同时伴随泛素蛋白增加和线粒体集合。还有一些研究表明自噬与感染性疾病、克罗恩病、寄生虫病、2型糖尿病等一系列疾病有关。自噬在疾病中的作用日益被人们重视,目前,国内对自噬在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)中的作用及其机制相关研究甚少。而新生儿缺氧缺血性脑损伤至今仍是造成围产期新生儿死亡和儿童伤残的主要原因之一,可致多个器官系统损害,其中受损最重的是神经系统,将遗留诸多后遗症,如脑性瘫痪、智力低下、癫痫及发育迟缓等。随着新生儿重症监护室的建立和抢救技术的提高,许多中、重度缺氧缺血性脑损伤患儿得以生存,但存活儿永久性脑功能障碍发病率仍较高。据统计,我国每年活产婴1800万-2000万,窒息发生率为13.6%。在窒息患儿中,不同程度伤残者的发生率为15.6%,每年新增30万残疾儿童。重度窒息有60%-80%发生HIBD,其病死率高,神经系统后遗症发生率约为30%-40%。目前,临床上对新生儿缺氧缺血性脑损伤的治疗多采用对症处理、营养支持、脑神经营养因子及早期干预等综合治疗,尚缺乏特效、经济的方法。因此,深入探讨HIBD损伤机制及其修复机制,为寻找新的治疗措施提供理论支持,对提高新生儿HIBD存活率,减少存活儿远期神经系统后遗症,提高我国人口质量有深远意义。本实验通过研究自噬相关蛋白Beclin1在新生鼠缺氧缺血性脑损伤后是否在海马及皮层组织表达,观察其水平时间依赖性的动态变化。应用自噬促进剂雷帕霉素(rapamycin)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)改变缺氧缺血性脑损伤后自噬表达水平,观察Caspase-3蛋白在海马及皮层组织的阳性表达,比较各组各时间点Caspase-3表达差异。从超微结构、分子水平上证实自噬的表达及其水平变化,对比各组不同时间点Caspase-3的表达差异,探讨自噬影响缺氧缺血性脑损伤的可能机制,为临床治疗缺氧缺血性脑损伤寻找新的治疗靶点提供新理论。实验方法：1.实验分组及HIBD大鼠模型制作清洁级7日龄SD大鼠303只,体重16-20g。其中216只随机分为假手术组、模型组、雷帕霉素组及3-甲基腺嘌呤组2h、4h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h等9个时间点,每组54只。结扎左颈总动脉和混合气体(92%氮气和8%氧气,1L/min)中缺氧2h制成HIBD模型。干预组在HIBD模型成功后0.5h进行腹腔注射一次,剂量分别为3-甲基腺嘌呤100nmol/μL,21μL和雷帕霉素1.0mg/kg。假手术组仅分离左颈总动脉,不进行缺氧处理。剩余78只大鼠,54只随机分为假手术组及模型组,在9个时间点取海马及皮层组织进行westernblot检测；24只分上述四组,24h时取海马及皮层组织进行western blot检测；9只为模型组,2h、4h、24h取海马组织行透射电镜检测。2.石蜡组织包埋及切片108只大鼠乙醚麻醉后,冰面上迅速断颈去颅骨,取厚度约3mm的海马冠状断面脑组织,迅速投入4%多聚甲醛固定液中于4℃下固定2天。固定好的脑组织按照常规石蜡标本包埋方法进行制作石蜡标本,石蜡组织切片机切片,切片厚度5μm。3.HE染色石蜡切片脱蜡水合后,经苏木素染色3min,1%伊红染色2min,中性树胶封片、晾干后在显微镜下观察、分析。4.电镜检测透射电镜检测模型组2h、4h、24h海马组织超微结构变化,观察线粒体及自噬体形态变化。5.免疫荧光免疫荧光检测各组Beclin1蛋白的分布与表达的变化,用荧光显微镜观察Beclin1各组的表达变化。6.Western blotWestern blot检测模型组和假手术组Beclin1表达,观察不同时间点Beclin1水平变化；及观察应用药物后Beclin1水平变化。7.免疫组化免疫组化检测HIBD后Caspase-3及突触素表达变化。石蜡切片抗原修复采用微波炉抗原热修复,抗原修复液为柠檬酸缓冲液(0.01mol.L-1, PH6),微波炉加热至煮沸后断电,反复三次,间隔7min。DAB显色,中性树胶封片、晾干后在显微镜下观察、分析。8.统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验；组间比较采用ONE-WAY方差分析,方差齐性时多重比较用LSD-t检验；方差不齐时多重比较用Dunnett’T3检验,以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果：1、通过HE染色观察假手术组与模型组脑组织病理改变,假手术组左侧海马及皮层组织厚而饱满,神经元排列整齐、有序,结构未见明显异常；模型组左侧海马及皮层组织神经细胞排列紊乱,部分神经细胞变性坏死,细胞周隙增宽,失去正常结构层次。2、脑缺氧缺血性损伤2h大鼠海马组织神经细胞核膜完整,染色质结构正常,胞质中线粒体形态分布正常,线粒体嵴清晰；4h线粒体肿胀,位于细胞核旁线粒体肿胀,线粒体嵴断裂、结构模糊；24h可见部分神经元细胞核染色质固缩、边集,线粒体内器官溶解,出现双层膜结构自噬体。3、免疫荧光可观察到假手术组9个时间点Beclin1少量阳性表达,模型组Beclin1表达2h开始增加,各时间点阳性表达明显比假手术组增加。雷帕霉素组阳性表达明显增加,而3-甲基腺嘌呤组阳性表达明显下降。Beclin1阳性表达分布在细胞质中,细胞核中无表达。4、Western blot结果可观察到发现HIBD后2h Beclin1蛋白表达开始增加,24h达到高峰,持续到168h(744.48+61.812,P<0.05)。在四组中,24h Beclin1阳性表达雷帕霉素组最高,模型组次之,假手术组较少,3-甲基腺嘌呤组最少。5、免疫组化可观察到Caspase-3日性细胞主要位于细胞质,呈棕黄色质棕褐色,弥漫分布于海马及皮层组织。模型组与假手术组相较,海马组织与皮层组织Caspase-3阳性表达平均光密度值各时间点明显增加；雷帕霉素组与模型组相较,Caspase-3阳性表达平均光密度值显著下降；而3-甲基腺嘌呤组与模型组相较,Caspase-3阳性表达平均光密度值显著增高。结论：1、新生大鼠HIBD模型能激活自噬发生,HIBD后24h达高峰,随着疾病发展而降低。2、自噬水平增高可抑制细胞凋亡,自噬水平降低可增加细胞凋亡。3、自噬可能通过调节细胞凋亡机制保护缺氧缺血性脑损伤后神经损伤。