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牛白血病病毒(Bovine leukemia virus,BLV)属于反转录病毒科(Retroviridae)丁型反转录病毒属(Deltaretrovirus)。BLV感染牛可呈现地方流行性牛白血病(Enzootic Bovine leukosis,EBL),是由牛白血病病毒引起的以淋巴细胞持续性增生为特征的慢性、肿瘤性疾病。EBL在全世界范围内散播,给养牛业造成巨大损失。EBL被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病。本研究针对gp51基因首次建立了检测病毒核酸的荧光定量PCR/RT-PCR方法和检测血清中特异性抗体的液相芯片方法。研究表明,所建立的方法具有特异性强、灵敏度高、方便快速的特点,将为我国地方流行性牛白血病的监测和血清流行学调查提供有效的技术手段,并为多重牛病血清液相芯片检测方法的建立奠定了基础。本研究主要进行了如下试验:
1、根据GenBank中注册的BLV gp51基因设计特异性LUXTM荧光定量引物,建立了快速检测BLV RNA的荧光定量RT-PCR方法和检测前病毒DNA的荧光定量PCR方法。所建立的BLV LUXTM荧光定量RT-PCR/PCR方法对牛白血病RNA、DNA、白血病阳性血清呈特异性反应,而对蓝舌病、病毒性腹泻.粘膜病、水泡性口炎、口蹄疫、牛流行热、牛传染性鼻气管炎等病毒核酸,牛结核分支杆菌、大肠杆菌核酸及健康动物组织核酸呈阴性反应。敏感性试验表明LUXTM荧光定量RT-PCR对BLV RNA的检测敏感性达0.49 ng。荧光定量PCR对T-blv-gp51质粒的检测敏感性可达13.8拷贝,比OIE规程的巢式PCR方法高100倍以上。采用该方法从临床牛血清中检出BLV阳性样品。
2、设计一对特异性引物gp51-F/gp51-R,从持续感染BLV的羊胎肾细胞(FLK-BLV)中提取前病毒DNA,用PCR方法扩增编码BLV gp51蛋白的基因序列,扩增出的基因片段克隆至pMD20-T载体后进行序列测定与分析,结果表明通过PCR 方法成功地扩增了BLV gp51基因。
3、将基因片段插入原核表达载体pBCX构建pBCX-gp51重组质粒,转化BL21 (DE3)表达宿主菌,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出通过大肠杆菌表达的融合蛋白分子量约为58Kda。Western-blot结果显示所表达的融合蛋白mysB-gp51具有结合特异性抗体的活性,通过纯化获得了可溶性蛋白mysB-gp51。
4、以纯化的重组蛋白mysB-gp51作为抗原,偶联检测微球,通过系列试验优化条件,建立检测BLV抗体的LiquiChip液相芯片检测方法。抗原gp51的最佳包被浓度为10μg/mL。血清的最佳稀释倍数为1:20,二抗最佳稀释度为1:2000,SA-PE 最佳浓度为5μg/mL。用该方法对169份牛血清进行检测阳性率为57.40％。