NUDC在毕赤酵母中的表达及其活性的进一步研究

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巨核细胞产生血小板是一个复杂的过程,受到多种细胞因子的调控。如白介素1、白介素3、白介素6、白介素11、干细胞因子、粒集落刺激因子、血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)等。TPO通过与巨核细胞表面的血小板生成素受体(Myeloproliferativeleukemia,MPL)结合,引导信号传导通路,在体外刺激巨核细胞集落(Colonyformingunitsofmegakaryocyte,CFU-MK)形成,在体内升高血小板的水平。然而,在巨核细胞成熟和血小板形成的过程中,TPO并不是必须的细胞因子。因为在TPO敲除鼠的实验中,虽然巨核细胞和血小板的数量减少85-90%,但并不影响血小板的功能。这说明在血小板的形成过程中可能存在其它因子的作用。 本实验室前期研究中,使用Mpl的胞外区(Mpl-EC)作为诱饵蛋白,用酵母双杂交系统,从人体胎肝cDNA文库中分离到了人核迁移蛋白(HumannucleardistributionC,hNUDC)与Mpl的胞外区相互作用。随后通过GSTpull-down、免疫沉淀和荧光定位试验证明了hNUDC是Mpl的另一个配体。NUDC首先是在丝状真菌Aspergillusnidulans中作为调控核迁移的nud基因发现的,A.nidulansNUDC基因在人中的同源物(hNUDC)已被克隆。hNUDC是一种在多种细胞中与微管动力中心结合并且相互作用的多功能蛋白。由于NUDC与TPO都与MPL结合,而两者又没有相同序列,为了检测NUDC是否与TPO具有相同的生物活性,在前期研究成果的基础上,克隆了人核迁移蛋白(hNUDC)和小鼠核迁移蛋白(mNUDC)基因,在毕赤酵母表达系统中表达了hNUDC和mNUDC,通过金属亲和层析柱纯化出了蛋白hNUDC-His和mNUDC-His,并且对hNUDC和mNUDC的生物活性作进一步的研究。 首先以人脐血CD34+细胞无血清液体培养时发现hNUDC-His可以显著增加巨核细胞的数目和促进巨核细胞的成熟。并且在无血清半固体培养时可以刺激形成巨核细胞集落(CFU-MK)。流式细胞检测结果显示出hNUDC-His可以明显增加巨核细胞的DNA倍性和体外产生的血小板的数量。在正常小鼠和骨髓抑制小鼠体内注射的实验中,进一步证明了hNUDC-His具有提高体内血小板数量的作用。 接着在以鼠巨核细胞研究mNUDC-His的活性时发现mNUDC-His具有体外促进巨核细胞的成熟,体内促进血小板升高的作用。mNUDC-His显示出了与hNUDC-His同样的生物活性。 总之,本论文的结果明确证明了NUDC在巨核系细胞的发育成熟和血小板的生成中具有重要的作用。
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