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K-ras是ras家族中的一员,在胰腺癌中的突变率高达90%。有文献报道,K-ras的基因突变与肿瘤的产生和进展有很密切的关系,而且K-ras的基因突变可能会导致一些抗肿瘤药物比如EGFR单抗类及EGFR-TKIs等药物的耐药,但K-ras的突变对化疗药物例如吉西他滨、5-氟尿嘧啶、顺铂和多西他赛等的药效是否会有影响鲜有报道。因此从细胞水平研究K-ras突变对胰腺癌化疗药物药效的影响及其机制有重要意义,可为临床试合理用药提供理论依据。目的通过携带不同K-ras基因的重组质粒将外源K-ras基因导入到人胰腺癌Bxpc-3细胞株中,研究K-ras基因对细胞的生长及其下游信号通路蛋白表达的影响,并研究K-ras不同突变型对厄罗替尼、吉非替尼、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多西他赛、SN-38和顺铂等抗肿瘤药物的影响。根据前期研究结果,深入研究了不同基因型K-ras对多西他赛药效的影响,并从细胞药效和药动两个方面探索其机制。方法将两端带有Bam HI和Xho I酶切位点的K-ras序列插入到pAcGFP1-C3载体质粒中,构建表达不同基因型K-ras (WT, G12V, G12R, G12D, G13D)的重组质粒pAcGFP1-KRAS-C3,转化入大肠杆菌中扩大培养并抽提质粒。将重组质粒转染进人胰腺癌Bxpc-3细胞株中,挑选出稳定转染的克隆并扩大培养,通过western blot的方法验证其表达效率。通过测定生长曲线的方法研究转染后细胞生长速率的变化并检测K-Ras突变对下游信号表达的影响。通过MTT的方法研究不同突变型K-ras对厄罗替尼、吉非替尼、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多西他赛和顺铂六种抗肿瘤药物药效的影响。研究K-ras不同突变型对化疗药物产生耐药的原因及导致差异的机制。PI单染后用流式细胞仪检测多西他赛对细胞周期的影响；用DAPI单染的方法研究多西他赛对细胞凋亡的影响,并测定凋亡蛋白PARP的表达。通过siRNA干扰确定K-ras与多西他赛诱导的细胞凋亡的关系,通过联用MEK抑制剂U0126研究多西他赛诱导凋亡作用的分子机制,并确定不同突变型K-ras对药效影响产生差异是否与MEK/ERK途径相关。通过高效液相色谱的方法检测不同K-ras基因型的细胞株对SN-38及多西他赛摄取的差异,研究K-ras突变与转运体表达的相关性,判断其是否是导致细胞耐药的原因。结果(1)成功构建K-ras野生型(WT)及各突变型(G12V.G12R, G12D, G13D)的pAcGFP1-KRAS-C3重组质粒,并建立其在人胰腺癌Bxpc-3细胞中稳定表达的亚克隆。用western blot的方法验证其K-Ras-GFP融合蛋白的表达,显示WT与各突变型的K-Ras-GFP融合蛋白表达量没有显著差异。Bxpc-3细胞转染不同的质粒后,生长速率出现差异。其中空载体(Vector)转染的细胞生长速率最快,G13D突变型转染的细胞生长速率最慢,其余各基因型间没有明显差异。对K-Ras下游信号的表达检测发现,不同突变型对Bxpc-3细胞内总AKT及总ERK的表达没有影响,但G12V突变型能显著增加AKT的磷酸化,而同时,G12V, G12R和G12D都能显著增强ERK的磷酸化。(2)在K-ras野生型(WT)及各突变型(G12V, G12R, G12D, G13D)的Bxpc-3细胞株上胰腺癌常用药物的药效学存在差异：结果显示,对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物,G12V和G12D突变型细胞上吉非替尼的药效显著低于WT细胞,而厄罗替尼在K-ras野生型和突变型细胞上的药效没有明显差异。对于细胞毒类化疗药物,G13D突变型细胞对吉西他滨药效降低,而其他突变型与野生型相比没有明显差异。G12D, G13D突变型对SN-38有显著耐药。G12V,G12D与G13D突变型细胞对5-FU有显著耐药。G12V, G12D和G13D都显示对多西他赛具有显著耐药性。K-ras的突变对顺铂的耐药性没有显著影响。(3) K-ras突变介导细胞毒类化疗药物多西他赛的机制研究结果显示,多西他赛对G12V突变型与野生型细胞周期阻滞的作用无显著差异。细胞用100nM多西他赛处理后用DAPI单染,发现突变型G12V和G12D中凋亡细胞的比例要低于WT组。多西他赛处理后,WT组中凋亡蛋白c-PARP的表达量要显著高于G12V. G12D突变型,且G12V突变型的细胞中表达量最低,与MTT法得到的各突变型对多西他赛的敏感性结果相一致。说明K-ras突变使细胞中多西他赛的促凋亡作用降低而导致细胞对药物敏感性下降。进一步对K-ras介导多西他赛药效降低的进行验证,结果显示siRNA干扰K-ras蛋白后,多西他赛处理的细胞凋亡作用增强,且该作用与K-ras下游信号蛋白p-AKT与p-ERK的表达不相关。联用MEK抑制剂U0126对这一结果进行验证,发现ERK的磷酸化被抑制后,p-AKT反馈性上调,但对凋亡蛋白c-PARP的表达和细胞存活没有显著影响。进一步说明K-ras介导多西他赛促凋亡能力的降低与K-ras下游最主要的PI3K/AKT与MEK/ERK两条信号通路都没有直接的联系。(4)对K-ras突变对药物的细胞药代动力学的影响进行了初步探索：用高效液相色谱法检测不同K-ras基因型细胞对转运体底物类药物多西他赛及伊立替康活性代谢物SN-38的摄取,发现K-ras突变的细胞株对这两个药物的摄取量要低于野生型细胞株。提示K-ras突变介导抗肿瘤药物药效降低的另一可能原因是通过降低药物在肿瘤细胞内的蓄积。结论不同基因型K-ras会对抗肿瘤药物产生不同的耐药效果,K-ras的一些突变型会导致细胞对吉非替尼、吉西他滨、5-FU,多西他赛和SN-38耐药,而对厄罗替尼和顺铂却没有显著的作用。机制研究显示K-ras基因的突变介导多西他赛药效降低的原因不是通过细胞周期阻滞作用,而是降低其诱导细胞凋亡的能力。但是K-ras基因突变对多西他赛促凋亡作用的抑制与K-ras下游最主要的两条信号通路PI3K/AKT与MEK/ERK途径都没有直接关系。论文还初步探索了K-ras突变对药物细胞药动学行为的影响,发现K-ras基因的突变与细胞对药物的摄取量下降相关,提示这可能是导致K-ras突变的细胞耐药的原因之一。本研究指出了K-ras突变可能导致耐药的抗肿瘤药物,并研究了K-ras突变导致耐药的机制,为一些临床试验结果提供了理论依据。