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研究背景：急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是一种由多种因素导致的以快速和严重的肝细胞损伤为特征,伴随着肝脏功能的缺失,导致了肝性脑病、凝血功能障碍、黄疸及进行性的多器官功能衰竭的临床综合征。目前,内科综合治疗效果较差；肝移植是治疗肝衰竭最有效手段,但是供肝短缺、排斥反应及长期使用免疫抑制剂伴随的并发症等,严重限制了其应用。近年研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)移植治疗急性肝衰竭取得了显著的疗效,它促进了肝细胞的再生和肝功能的恢复,为急性肝衰竭的治疗提供了新的方向。中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分；当肝脏组织出现坏死和炎症时,大量中性粒细胞向其趋化,通过分泌炎症因子及氧化爆发,进而导致肝细胞的大量坏死。血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血红素代谢的限速酶,具有抗氧化、抗凋亡、免疫调节功能。有研究表明,MSC可以诱导体内HO-1蛋白的表达,但MSC是否能通过诱导HO-1进而抑制中性粒细胞对肝脏的二次打击尚不可知。本研究在建立D-氨基半乳糖联合内毒素所致ALF的大鼠模型,探讨MSC是否通过诱导HO-1的表达来抑制中性粒细胞的活性及其向肝脏的趋化来缓解ALF,为MSC移植治疗AL F的机制提供理论依据。研究方法：第一部分：将72只SD大鼠随机分为对照(Contro1)组：腹腔注射生理盐水；急性肝衰竭(ALF)组：腹腔注射D-Gal 0.8g·kg-1及LPS 20μg·kg-1; MSC治疗组：在诱导急性肝衰竭6h后MSC治疗组给予1x106个/ml SD大鼠来源的骨髓MSC阴茎背静脉注射。观察第24h、48h、72h、120h和148h血谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及胆红素(T-bil)的变化趋势及肝脏的病理变化。(1)自动生化仪检测大鼠NH3、ALT及AST水平(n=14);(2)观察各组大鼠生存率(n=10)；(3)显微镜观察大鼠肝脏苏木紫-伊红染色(n=14)；(4)流式细胞仪用于鉴定间充质干细胞纯度(CD29、CD34、CD44、CD45、CD90)。第二部分：将120只SD大鼠根据随机数字表法分为5组,即对照组(control):腹腔注射生理盐水、急性肝衰竭(ALF)组：腹腔注射D-Gal 0.8g·kg-1及LPS 20 μg·kg-1制作急性肝衰竭模型：MSC治疗(ALF+MSC)组；给予D-Gal及LPS(方法同急性肝衰竭组),6h后大鼠阴茎背静脉移植含106个骨髓间充质干细胞的1ml PBS溶液;ALF+MSC+锌原卟啉(Znpp, HO-1拮抗剂)组：在MSC治疗组的基础上给予Znpp 50 μmol·kg-1腹腔注射；血晶素(Hemin, HO-1诱导剂)治疗(ALF+Hemin)组：给予D-Gal及LPS,6h后腹腔注射Hemin 40 μmol·kg-1,每组24只。分别于诱导肝衰后1、3、5、7天断尾取血,使用全自动生化仪检测肝功能；取48h肝脏组织,免疫组化检测中性粒细胞(MPO)、增殖(Ki67)、凋亡(Tunel)及血红素加氧酶-1(HO-1)表达情况：Western blot检测肝脏HO-1及相关通路(p38、Erk、JNK及NF-κB)水平变化；流式细胞仪用于检测外周血中性粒细胞氧化爆发(DHR123)情况；同时检测肝脏NDA、MPO活性及HO-1活性变化；酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠炎症因子(IL1β、TNFα、IFNγ)水平变化。结果：研究第一部分：成功建立D-Gal联合LPS诱导的ALF模型,急性肝衰竭后血AST、ALT及T-bil水平明显升高：当使用MSC静脉移植治疗后,大鼠血NH3、AST、T-bil及ALT水平出现明显下降(p<0.05),大鼠肝脏苏木紫-伊红染色显示MSC治疗后肝脏损伤程度减轻；ALF组大鼠死亡率为80%,MSC治疗组大鼠死亡率为下降为40%。研究第二部分：Western blot及免疫组织化学染色显示HO-1水平在A LF+MSC组、ALF+MSC+ Znpp组及ALF+Hemin组中都出现明显升高(p<0.05)；HO-1活性在ALF+MSC组和ALF+Hemin组中上升明显,而在ALF+MSC+ Znpp组其活性出现下降(p<0.05)。ALF组肝脏组织损伤严重,血NH3、AST及ALT水平升高(P<0.05),MPO、Tunel阳性的中性粒细胞数量增多,外周血中性粒细胞的氧化爆发能力(P<0.05)、MDA及MPO活性都出现了升高(P<0.05), IL1β、TNFα、IFNγ升高(P<0.05)；在MSC移植或Hemin治疗后肝脏病理损伤情况下降,血NH3、AST及ALT水平下降(P<0.05), MPO及Tunel阳性细胞数量下降(P<0.05),同时Ki67阳性的细胞数量升高(P<0.05)：外周血中性粒细胞的氧化爆发能力下降(P<0.05)、肝脏MDA及MPO活性都出现了下降(P<0.05),血清IL1β、TNFα、IFNγ下降。然而,Znpp使MSC的治疗作用部分消除。Western结果显示NF-KB通路参与了HO-1介导的保护作用。结论：(1)骨髓间充质干细胞移植可缓解急性肝衰竭体内炎症反应,减轻D-Gal+LPS所致ALF；(2)中性粒细胞及氧化应激在急性肝衰竭中具有重要的作用；(3)MSC通过诱导肝脏HO-1蛋白水平及活性,从而抑制氧化应激水平及中性粒细胞浸润,从而缓解大鼠急性肝衰竭。