研究目的:复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是连续发生3次及3次以上的妊娠失败,大多数发生在妊娠早期的流产。RSA的发病因素很多,如血栓、免疫、遗传及解剖异常等。目前,复发性流产的病因以及发病的机制较为复杂,至今尚未明确。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一个含巯基的氨基酸,是蛋氨酸代谢的过程中产生的重要的中间产物。大量的临床流行病学及实验室研究资料表明Hcy升高与心脑血管病、血栓性疾病密切关联。近期也有研究提示血浆Hcy水平的升高是复发性流产的又一个危险因素。因此,本文将通过对临床样本的检测,验证血浆Hcy水平与RSA的关联,通过细胞分子生物学的实验方法,研究Hcy对血管内皮细胞功能作用的影响,并探讨RSA血浆Hcy变化的分子机制。研究对象1.正常早孕组:40例,在苏州大学附属第二医院妇产科计划生育门诊就诊妇女,以前没有发生过自然流产史,已经生育过健康的子代者,平均年龄为(27.5±4.3)岁,就诊时经血液检查HCG升高,以及超声影像学可以见到妊娠囊和卵黄囊,证实正处于妊娠状态;抽取人流前外周血,平均停经的时间为(54.4±4.1)天。本组的研究对象须排除以下异常:1.以往发生过自然流产和胎停史的患者;2.妊娠前发生基础性疾病史;3.患者有腹痛和阴道流血等先兆流产的征象。2.RSA组:40例,为2017年01月01日至2017年08月31日在苏州大学附属第二医院生殖中心门诊就诊的妇女,以往与同一个配偶发生过连续3次以上的胚胎停止发育流产的患者,平均年龄为(31.2±5.8)岁,就诊时经血液检查HCG升高,以及超声影像学可见到妊娠囊及卵黄囊,证实此次妊娠状态,后又经超声诊断为空孕囊,或有胚芽但无胎心,抽取人流前外周血,流产患者的平均停经时间为(64.2±6.7)天。本组研究对象须排除妊娠前的以下异常:1.生殖道解剖异常;2.成功妊娠前的基础性疾病史;3.低纤维蛋白血症和血小板增多症;4.自身抗体阳性:抗核抗体、抗磷脂抗体等其他;5.异常甲状腺激素及抗甲状腺抗体阳性;6.血栓前的病理状态;7.阴道分泌物检测支原体、衣原体以及解脲支原体阳性;8.夫妻双方的染色体缺失或核型异常。研究方法1.采集正常妊娠及RSA患者外周血,离心获得血浆,用同型半胱氨酸的试剂盒检测血浆中Hcy水平。2.用细胞表面标记物抗体标记MPs,用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分析正常妊娠及RSA妇女血浆中MPs总数量及EMPs数量。3.用核酸结合荧光染料PicoGreen检测正常妊娠及RSA妇女血浆中游离DNA水平。4.用不同浓度Hcy溶液刺激HUVEC,用CCK8方法检测Hcy对HUVEC生长的影响;用碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色,FCM检测PI染色阳性细胞数;用FCM检测HUVEC释放的EMPs数量。5.用流式细胞术检测正常妊娠及RSA妇女血浆中细胞因子水平。6.采集正常妊娠妇女及RSA妇女的绒毛组织,实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法,检测MTHFR、CBS、MAT1A及BHMT的mRNA表达水平。研究结果1.与正常妊娠妇女比较,RSA妇女的血浆同型半胱氨酸浓度显著增高。2.与正常妊娠妇女比较,RSA妇女血浆MPs总数及EMPs数量,血浆中游离DNA水平显著升高。血浆MPs总数与血浆游离DNA水平之间呈正相关。3.用不同浓度的Hcy(0、1.5、1、2、4、8 mmol/L)处理HUVEC细胞,发现与正常对照组比较,Hcy刺激后,HUVEC细胞存活率明显降低,PI染色阳性细胞数量显著增加,HUVEC细胞释放的EMPs数量显著增加。4.检测血浆细胞因子,发现RSA妇女血浆IL-2和TNF-α(Th1分泌)显著高于正常妊娠妇女,存在Th1/Th2免疫调节失衡,偏向Th1。5.实时定量PCR检测胎盘绒毛中Hcy代谢相关蛋白酶,发现RSA妇女绒毛组织中的MAT1A mRNA表达水平显著低于与正常对照。结论通过上述实验研究,我们发现RSA妇女血浆Hcy升高,高Hcy血症可能是RSA的独立的危险因素。流产患者胎盘绒毛组织中MAT1A缺乏,可能导致代谢过程中Hcy产生增加,导致RSA妇女血浆Hcy水平升高,刺激内皮细胞发生氧化应激,损伤血管内皮细胞。此外,Th1/Th2调节失衡可能也是RSA发生的原因之一。因此,本研究阐述了Hcy在复发性流产中的作用及分子机制,也为RSA的早期诊断和防治提供了新的思路和治疗靶点。