卵巢上皮性癌是世界上最常见的妇科恶性肿瘤之一,其病程发展迅速,每年导致140,000病例死亡。由于早期无明显症状,且缺乏有效的早期诊断方法,70%患者就诊时已属晚期,死亡率占所有妇科恶性肿瘤相关死亡的52%。而有关卵巢癌的发病机制目前仍尚未完全明确。大量研究表明,microRNA(miRNA)与多种疾病的发生、发展密切相关。许多miRNA一直被认为是细胞生长与分化的关键调节因子,近几年研究发现miRNA也参与肿瘤的发生、发展,发挥类似于抑癌基因或癌基因的作用,参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及转移过程。有报道指出一些miRNA异常调节肿瘤中增殖,其中包括卵巢癌。而与肿瘤相关的miRNA可通过调节恶性肿瘤细胞中DNA甲基化和组蛋白修饰从而改变表观遗传的表型。目前,大量研究显示在恶性肿瘤和异常增生的细胞中,Hox基因异常表达,这表明改变Hox基因的表达对于致癌基因或肿瘤的抑制都很重要。许多Hox基因被认为能够在某些癌症中影响癌基因启动子通路和肿瘤代谢,如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病。Hox基因如HoxA9、HoxA10、 HoxA根据肿瘤分化方式在不同的上皮性卵巢癌亚型中都有表达,这表明Hox基因在决定卵巢癌组型中起重要作用。但是miRNA在HoxB3中的作用尚不清楚。另一方面,有研究显示RASSF1A和CLDN6作为重要的抑癌基因,与HoxB3及表观遗传密切相关。国内外学者检测到卵巢癌、宫颈癌组织中RASSF1A和CLDN6基因异常甲基化。然而,有关miRNA在卵巢癌当中的作用研究报道并不多,且未有文献报道miRNA与HoxB3在卵巢癌中的关系。本研究首先通过miRNA芯片技术,筛选出在卵巢癌组织中下调表达的miR-7和miR-218,发现miR-7和miR-218与HoxB3的表达密切相关,且它们的表达水平呈负相关,miR-7和miR-218可以直接调控HoxB3的表达。而过表达miR-7和miR-218的卵巢癌细胞,通过表观遗传DNA甲基化改变和组蛋白修饰的方式,重激活肿瘤抑制因子RASSF1A和Claudin-6,以增强对卵巢癌细胞细胞周期的阻滞和克隆形成的抑制作用。该研究为人卵巢上皮性恶性肿瘤中HoxB3基因过表达和miRNAs之间的关系提供了一条新的思路,从miRNAs角度探讨了卵巢癌的发病机制,即miRNAs可能通过靶向调节HoxB3使肿瘤抑制基因表观遗传化改变,从而影响卵巢癌细胞增殖。第一章利用芯片技术进行卵巢上皮性癌组织miRNA的表达谱的研究——miR-7和miR-218表达下调目的：探讨miRNA在卵巢上皮性癌中的表达谱。方法：通过Agilent公司的miRNA芯片技术分析13例原发性卵巢上皮性癌Ⅰ期患者的卵巢癌组织及其对侧正常卵巢上皮组织miRNA表达谱差异,并通过Real-time RT-PCR验证芯片所得结果,；原13例原发性卵巢上皮性癌Ⅰ期患者的卵巢癌组织连同再取的19份卵巢上皮性癌组织(Ⅱ期6例,Ⅲ期10例,Ⅳ期3例)检测差异表达最明显的miRNA在卵巢癌癌组织不同病理分期中的的表达情况,筛选出在卵巢癌癌组织中差异表达最明显的miRNA进行下一步的功能研究。结果：芯片结果显示,与对侧正常卵巢上皮组织相比,卵巢癌组织3个miRNA表达上调,分别为miR-221, miR-222, miR-146b;有10个miRNA表达下调,分别为miR-21, miR-7, miR-218, let7家族(miR-let7a, let7b, let7c, let7d, let7e, let7f, let7g)其中miR-7和miR-218下调最为明显,与qRT-PCR验证的结果相一致。miR-7和miR-218的表达随着肿瘤级别的增加而逐渐降低,差异有统计学意义。结论：①卵巢癌癌组织与其对侧正常卵巢上皮组织之间存在miRNA差异表达,其中miR-7和miR-218下调表达程度还与卵巢癌分期有关。②miRNA芯片技术检测结果可靠,可用于筛选组织、细胞间的miRNA表达谱。第二章miR-7和miR-218对卵巢癌细胞的增殖能力和HoxB3基因的调节作用目的：研究卵巢上皮性癌中miR-7和miR-218对卵巢癌细胞的增殖能力和HoxB3基因的作用。方法：应用分子生物学方法预测miR-7和miR-218的靶基因。常规培养人卵巢癌细胞株SKOV-3、OVCAR-3和正常卵巢上皮细胞株IOSE80。定量RT-PCR检测miR-7和miR-218在卵巢细胞中的表达量。进行脂质体瞬时转染后,软琼脂糖克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖能力的改变,Western-blotting用于检测HoxB3蛋白水平的改变。结果：采用TargetScan和miRanda网站预测到HoxB3为miR-7和miR-218的靶基因。荧光定量PCR结果显示,miR-7和miR-218在卵巢癌细胞株中发生不同程度的下调,而HoxB3的蛋白表达则明显增强。Western Blot结果显示,转染外源性miR-7和miR-218到SKOV-3细胞后,随着增加miR-7和miR-218的表达,细胞中HoxB3蛋白表达水平明显减弱,转染miR-7和miR-218到SKOV-3细胞中,流式细胞术数据表明G1期细胞呈上升趋势,对照组48%,miR-7转染组为61.2%,miR-218转染组为64.3%,miR-7+miR-218共转染组为71.2%。S期细胞呈下降趋势,对照组为36.7%,miR-7转染组25.9%,miR-218转染组24.1%,miR-7+miR-218共转染组18.7%。然而,G2/M期细胞趋势则有所变化,对照组15.3%,miR-7转染组为12.9%,miR-218转染组为11.6%,miR-7+miR-218共转染组为10.1%。而软琼脂克隆形成实验显示miR-7和miR-218减少了卵巢癌细胞SKOV-3软琼脂上的克隆形成。结论：以上结果证实miR-7和miR-218可以下调HoxB3基因的表达。miR-7和miR-218可以抑制卵巢癌细胞的生长,可以将细胞周期阻止在G1/s期。这些结果说明在卵巢癌中异常表达的miR-7和miR-218通过抑制HoxB3,进而影响细胞增殖能力。综上说明miR-7和miR-218在卵巢癌的发生发展中发挥抑癌基因的作用。第三章miR-7和miR-218靶向调节HoxB3的机制研究目的：验证miR-7和miR-218对HoxB3的靶基因机制调节。方法：构建含HoxB3-3’UTR结合位点的荧光素酶报告载体,与miR-7和miR-218表达载体共转染,检测细胞中的荧光素酶活性。结果：成功构建含HoxB3-3’UTR结合位点的荧光素酶报告载体,miR-7和miR-218表达载体与含HoxB3-3’UTR结合位点的报告载体共转染可以抑制细胞中的荧光素酶活性,降低荧光素活性比值,且两者有协同作用。结论：miR-7和miR-218与HoxB3的表达密切相关,miR-7和miR-218靶向调节HoxB3,且两者有协同作用。第四章miR-7与miR-218对肿瘤抑制基因RASSF1A和Claudin-6影响的机制研究目的：研究miR-7和miR-218对RASSF1A和CLDN6表达影响的机制。方法：首先转染miR-7和miR-218到SKOV-3细胞中,研究细胞RASSF1A和CLDN6基因mRNA表达的改变；接着甲基化RASSF1A和CLDN6基因,研究DNA甲基化是否影响转染miR-7和miR-218的SKOV-3细胞的RASSF1A和CLDN6,并通过染色质免疫共沉淀,研究DNMT3b是否涉及RASSF1A和CLDN6的高甲基化以及miR-7和miR-218对RASSF1A和CLDN6的组蛋白乙酰化(H3乙酰化)的水平。结果：单独转染miR-7和miR-218后,编码RASSF1A和CLDN6的mRNA表达水平增加,而共转染miR-7和miR-218后,它们显著协同上调这些mRNA。DNA甲基化显著下调了转染miR-7和miR-218的SKOV-3细胞的RASSF1A和CLDN6,而染色质免疫共沉淀结果显示,转入miR-7和miR-218可以大幅下调与DNMT3b相关的RASSF1A和CLDN6, miR-7和miR-218可以显著上调RASSF1A和CLDN6的组蛋白乙酰化(H3乙酰化)的水平。结论：miR-7和miR-218可以增加RASSF1A和CLDN6基因的mRNA表达水平,miR-7和miR-218使RASSF1A和CLDN6发生表观遗传改变而被重新激活。