背景／目的：结直肠癌是目前全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率在各种恶性肿瘤中排名约为第3位。结直肠肿瘤在我国的发病率虽略低于西方发达国家,但是近年来随着我国经济社会的快速发展,肉类等高糖高脂食物的比重增加,结直肠肿瘤发病率在我国近些年来也是逐年上升。肿瘤异质性(heterogeneity)是包括结直肠肿瘤在内的多种恶性肿瘤的特征之一,其包括肿瘤内部的异质性和肿瘤之间的异质性,实际上,肿瘤异质性的表现形式主要分为两种：一种是其内在的异质性表现即基因结构不同,另一种是外在的异质性表现即肿瘤形态的差异；而两种异质性的表现形式从根本上讲是由内因推动外因产生的。因肿瘤内部基因突变产生的肿瘤内基因异质性始于肿瘤的发生,在肿瘤发展过程中不断演变,最终影响了肿瘤个体上的种种异质性。正是由于结直肠肿瘤中异质性的存在,因为突变或变异存在随机性,所以同种病理分型的结直肠肿瘤组织中可以有多种不同基因型的肿瘤细胞组成,这也是相同病理分型的肿瘤患者在接受相同的治疗方案后,预后差异明显的原因之一。目前的研究热点之一,肿瘤靶向治疗,就是根据某些肿瘤在某一信号通路过度活化后导致相应的蛋白分子过度表达而形成所谓的“热点”,肿瘤靶向药物就是根据这些“热点”而设计出来的一些具有干扰相应信号通路的生物制剂。正是基于这种原理,所以靶向治疗与传统的化疗药物相比,具有毒副作用低,效价高,选择性强等优点,而且还在一定程度上避免了耐药性的产生。目前已发现的结直肠癌分子靶点主要包括表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)、选择性环氧合酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)等,其中研究得较多的是EGFR和VEGF。近年来越来越多研究表明,PI3K/Akt/mTOR信号通路在结直肠癌的原发病灶和转移灶中的阳性率要远远高于其癌旁正常组织。因此本课题认为深入研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路可以帮助理解多种恶性肿瘤的产生及进展过程,也很有可能为结直肠肿瘤的诊断、治疗和预后判断提供一定的理论基础。现有研究显示PI3K/Akt/mTOR信号通路的过度活化与结直肠肿瘤的发生、发展密切相关,是肿瘤治疗的一个重要靶点。mTOR在生物体以两种复合物的形式存在,即]nTOR复合物1 (mTORC1)及mTOR复合物2 (mTORC2)。目前研究较多的是mTORC1复合物,而对mTORC2复合物研究相对较少,Rictor(rapamycin insensitive companion of mTOR)是组成mTOR复合物2不可或缺的一部分,现有研究证明Rictor蛋白在多种恶性肿瘤中存在过表达,例如：肝癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌、贲门癌以及乳腺癌等,胃肠道间质瘤和结直肠癌中也存在mTOR信号通路的异常表达,近年来越来越多的数据显示结直肠癌中尤其是晚期结直肠癌中存在Rictor蛋白的异常表达。介于Rictor蛋白可参与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路中Akt蛋白的表达,一旦Rictor蛋白失去活性,mTOR也将不再有明显的激酶活性；所以考虑Rictor蛋白的多个结构域在PI3K/Akt/mTOR信号通路中参与重要的调控功能。有研究者通过裸鼠接瘤造模实验,发现Rictor基因低表达的前列腺癌细胞的成瘤能力明显降低,甚至Rictor基因的缺失还能提高裸鼠的抗肿瘤能力,有研究者分别在子宫内膜癌和贲门癌中应用PCR和免疫组化技术检测Rictor的表达情况,实验结果证明无论是PCR检测到的基因拷贝数还是免疫组化检测到的Rictor蛋白量,癌组织中Rictor的表达量明显高于癌旁周围正常组织,同时这也进一步证明了rictor蛋白与多种恶性肿瘤的发生、发展、预后、转归甚至耐药性密切相关,基于上述理论基础,本课题考虑在结直肠肿瘤中也进一步验证这一结论。Chitose Oneyama等研究显示： miR-424/503通过抑制Rictor表达而抑制包括前列腺和结肠肿瘤在内的多种人类肿瘤的发生、发展。但目前还没有学者针对Rictor与结直肠癌临床病理分期、分级、淋巴结转移和预后中的价值进行报道。本课题考虑到Rictor蛋白的异常表达可能与结直肠癌的发生、发展和预后转归有关。鉴于此,本课题拟采用免疫组织化学法在临床收集的组织标本中检测结直肠癌组织中Rictor蛋白表达的情况,并通过统计软件SPSS分析结直肠癌的各种临床病理参数是否与Rictor表达也存在一定的相关性；同时在细胞层面进一步验证Rictor蛋白和mTOR蛋白在结直肠肿瘤中存在过表达。方法：收集并分析我院2008年6月至2010年8月手术切取的62例结直肠癌及癌旁正常黏膜标本。其中癌旁正常黏膜组织均取自肿瘤切缘1≥5 cm处,经病理学检查取材干净,无癌细胞浸润。肿瘤切片常规苏木精一伊红(HE)染色进行病理诊断及病变分型,观察结直肠癌手术标本的肿瘤分化程度和浸润情况,并参照国际抗癌联盟的TNM分期判别标准进行分期,肿瘤组织切片对应的癌旁正常组织切片两两一组,癌组织切片为实验组,癌旁正常组织为对照组,免疫组化染色分析Rictor蛋白在每组切片中的表达情况,收集相应数据并采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。根据研究目的,组间率的比较采用x 2检验或Fisher确切概率检验,利用Kaplan-Meier法和log-rank检验进行生存分析,P<0.05表示差异存在统计学意义。体外细胞实验采用免疫荧光和蛋白质免疫印迹(western blot)技术检测HCT116、SW480、LoVo和HCoEpiC四种细胞中Ricto和mTOR的表达情况。免疫荧光定性检测四种细胞中是否都有Rictor蛋白和mTOR蛋白的表达,同时初步判断肿瘤细胞株中两种蛋白的表达量与人正常结肠上皮细胞株中两种蛋白的表达量是否存在差异；western blot实验定量检测两种蛋白在四种细胞中的表达差异是否有统计学意义。结果：1、我院2008年6月至2010年8月手术切取的62例结直肠癌患者中男性34例,女性28例,年龄30～88岁,中位年龄66岁。所有患者术前均未接受放疗或化疗；由2名有经验的病理科医师对全部病例切片进行复查。常规对切片进行HE染色,从而在确定病理诊断结果后,对组织切片的一些基本病理学参数进行归总,其中主要包括肿瘤大小、浸润深度、病变类型、分化程度、TNM分期、Dukes分期等。结果显示其中中低分化41例,高分化21例,并参照国际抗癌联盟的TNM分期判别标准进行分期,其中Ⅰ/Ⅱ期患者28例,Ⅲ/Ⅳ期34例。2、免疫组化法检测Rictor蛋白定主要位于细胞质,阳性表达显示棕黄色,Rictor在结直肠癌组织中的阳性表达率为58.1%(36/62),而在癌旁正常组织的阳性表达率为14.5%(9/62)。Rictor蛋白在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常结直肠组织,差异有统计学意义(P<0.05)。3、统计学相关性分析结果显示：Rictor蛋白在结直肠癌组织中的表达与肿瘤的Ducks分期及淋巴结转移相关(P<0.05),但是同时也显示与患者的肿瘤大小、分化情况、浸润程度、组织学分型以及年龄、性别等的相关性无统计学意义(P>0.05)。结果如表1所示。4、Kaplan-Meier生存分析结果：结直肠癌患者的生存时间与Rictor蛋白表达水平的关系显示Rictor蛋白表达水平与患者的生存期相关：Rictor蛋白表达阳性患者总生存时间明显小于表达阴性者,log-rank检验其差异具有统计学意义(P<0.05)。5、共聚焦荧光显微镜观察,结果显示免疫荧光双标记染色HCT116、SW480、 LoVo和HCoEpiC四种细胞中Rictor和mTOR的表达情况,结果显示四种细胞中Rictor和mTOR都有表达,且两种蛋白在细胞质中表达量未见明显差异,Rictor和mTOR两种蛋白的表达量多少无法准确判定,因此行western blot实验进行定量比较。6、Western blot检测]mTOR和Rictor两种蛋白结果显示：三种结直肠肿瘤细胞系中的mTOR条带和Rictor条带宽于人正常结肠上皮细胞中的蛋白条带；Image J软件定量分析结果同样显示：HCT116、SW480和LoVo三种肿瘤细胞中mTOR和Rictor两种蛋白的表达量要高于HCoEpiC细胞中对应的两种蛋白的表达量。结论：体外实验中蛋白质免疫印迹结果显示：大肠癌细胞中Rictor蛋白和mTOR蛋白的表达水平高于人正常结肠上皮细胞HCoEpiC中两种蛋白的表达水平,免疫组化分析临床病理切片结果显示：大肠癌组织中Rictor的表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.05),体内试验和体外试验都表明Rictor蛋白在肿瘤病灶中存在过表达,考虑Rictor蛋白与结直肠癌的发生、发展有关,因此能否将Rictor蛋白作为治疗结直肠肿瘤的一个靶点值得进一步的试验研究；免疫组化结果分析后显示：Rictor蛋白的表达与结直肠癌组织Ducks分期及淋巴结转移有关(P<0.05),与其他临床病理参数尚不能认为有相关性(P>0.05); Rictor蛋白表达阳性患者的总体生存期低于Rictor蛋白表达阴性的患者,所以考虑Rictor蛋白在结直肠癌中的过表达可能与结直肠癌临床治疗中药物抵抗、肿瘤切除术后转移情况有关,即与结直肠肿瘤的预后有关,因此我们考虑可将Rictor作为判断大肠癌预后的潜在指标。由于本实验属于回顾性分析,而且病例来源相对局限；实验方法方面只是在体外实验细胞层面和临床病理切片内验证了Rictor蛋白的表达情况,如能在基因层面进一步确认,那么实验结果将更有说服力。而且实验内容层面也只是做了Rictor蛋白的功能性研究,至于Rictor和mTOR蛋白的分子机制研究还需要更多的实验来揭示。总之,本研究验证了Rictor和mTOR蛋白在结直肠癌中存在高表达,其中Rictor蛋白表达水平与肿瘤的Ducks分期及淋巴结转移密切相关,是结直肠癌的一项可以临床监测预后的指标。本课题的以上工作为结直肠癌中Rictor和mTOR蛋白在的功能研究提供了一定的理论基础,也希望该部分实验内容及结果在肿瘤的诊断和治疗进程中能为后来者提供一点思路和想法。