CRISPR-Cas获得性免疫系统来源于细菌和古细菌,是用来防御病毒、质粒等外源核酸类物质入侵的重要措施,该系统免疫过程分为三步:Spacer获取、crRNA生成和DNA干扰。在DNA干扰阶段,CRISPR-Cas系统效应酶分子Cas9或Cas3等在crRNA的导向下结合到入侵核酸特定位点,发挥核酸解旋酶和内切酶活性对靶标D NA进行切割。这一特点被科研人员用来对生物体的基因组DNA进行定点精准切割,然后利用体内同源重组方式,以合成DNA为模板修复被切割片段,实现对基因组DNA信息进行编辑的目的。相比于其他基因组编辑工具,CRISPR-Cas系统因其导向分子crRNA容易改造,且能够同时在多种crRNA的导向下编辑多个靶点,具有巨大的技术优势,成为近年来的研究前沿和热点。因为CRISPR-Cas系统可能从根本上治愈镰状细胞性贫血等多类遗传病,以及可以帮助科研人员快速、有效地获得基因敲除的动物或细胞系,因而具有令人激动的潜在应用价值。然而,由于Cas9和Cas3等CRISPR-Cas系统效应酶分子存在脱靶效应,可能导致不可预测的错误后果,因而在生物治疗以及其他应用方面上存在着潜在的严重安全问题。如何在时间和空间上有效地和选择性地抑制这些效应酶分子是当前一个重要科学问题。在生物共进化过程中,噬菌体也进化出了独特的抑制CRISPR-Cas系统的蛋白,即anti-CRISPR蛋白。目前已经发现来源噬菌体的AcrF3蛋白能够有效抑制I-F型CRISPR-Cas系统效应酶分子Cas3,但具体作用机制完全不清楚。揭示全新anti-CRISPR蛋白AcrF3的作用机制,对于人们有效调控CRISPR-Cas系统效应酶Cas3的活性以及降低其脱靶效应等具有重要意义。我们首先表达纯化了来源于绿脓杆菌的Cas3效应酶分子(简称PaCas3)与其anti-CRISPR蛋白AcrF3,通过生化研究发现AcrF3以同源二聚体的方式作用于PaCas3,同时揭示了 PaCas3是一个二价金属离子依赖的核酸酶。然后通过解析PaCas3-AcrF3复合物2.6埃高分辨率的晶体结构,发现PaCas3的一个全新结构特点,其氨基端具有一个独立Cas2结构域,使得PaCas3具有既参与Spacer获取又参与DNA干扰的双重功能。进一步研究发现,AcrF3先以反向对称的方式形成同源二聚体,然后结合于PaCas3长Linker区和羧基端结构域(CTD)之间的凹面区域,与PaCas3的HD核酸酶结构域、长Linker区、RecA2亚结构域和CTD之间存在大量相互作用。分析AcrF3抑制PaCas3的各个角度,我们得出,AcrF3同源二聚体通过阻止PaCas3获取DNA底物、阻止Cascade Cse 1亚基识别PaCas3和将PaCas3锁定在失活状态以破坏PaCas3被Cascade募集及其核酸酶和解旋酶活性发挥的三个必要条件,达到完全抑制细菌I-F型CRISPR-Cas免疫系统的目的。此外,生化实验结果表明,相对于所检测的I-E型Cas3,AcrF3只特异性地作用于I-F型PaCas3,进一步通过序列比对和结构分析发现,在PaCas3中,与AcrF3相互作用的23个位点,除202位外,各位点上的氨基酸残基均是PaCas3所特有的,说明这些位点上的氨基酸残基所参与的相互作用可能共同决定了 AcrF3对PaCas3的特异性结合。该研究成果在国际上首次揭示了 CRISPR-Cas免疫系统被anti-CRISPR蛋白抑制的一种具体分子机制,首次报道了 CRISPR-Cas免疫系统效应酶分子与anti-CRISPR蛋白复合物的高分辨率三维结构,首次向人们展示了 I-F型CRISPR-Cas系统效应酶分子的全新生化机制和结构特点,不仅从多个角度描述了细菌与噬菌体之间长期共进化过程中的一幅精彩画面,而且为人们安全应用CRISPR-Cas基因组编辑系统等提供了重要启示。